1.6统计学分析
实验数据用SPSS 15.0软件包建立数据库（SPSS Inc， Chicago， IL），并进行统计学分析.数据表示为±s，经方差齐性检验后，用单向方差分析（One Way ANOVA）对多组均值进行比较，用LSD法对均值进行两两比较.P<0.05为差异具有统计学意义的标准.
2结果
21亚毒性浓度的AFMC、TRAIL及两者合用对人肺癌A549细胞凋亡的影响
PI染色FCM分析显示：1.0 μmol/L AFMC、30 μg/L TRAIL单用以及两者合用的A549细胞凋亡率（SubG1细胞百分率）分别为2.53%±0.35%，269%±0.52%，37.80%±1.78%.两者合用的细胞凋亡率是各自单用时细胞凋亡率之和的7.2倍（P<0.05，图1）.A549细胞凋亡率在两者合用12 h后开始增加，24 h达高峰（图2）.提示亚毒性浓度的AFMC能增敏TRAIL诱导人肺癌A549细胞凋亡.
22 亚毒性浓度的AFMC、TRAIL及两者合用对人肺癌A549细胞DNA断裂的影响
DNA琼脂糖凝胶电泳显示： 1.0 μmol/L AFMC或30 μg/L TRAIL分别作用于人肺癌A549细胞24 h，未见凋亡特异性的DNA梯形条带，而1.0 μmol/L AFMC预孵育30 min后，再加入30 μg/L TRAIL处理24 h，展现典型DNA梯形条带图谱（图3A）.进一步证实：亚毒性浓度的AFMC具有增强TRAIL诱导人肺癌A549细胞凋亡作用.
23AFMC对人肺癌A549细胞DR5蛋白表达的影响
Western Blotting分析表明：AFMC以浓度和时间依赖方式上调A549细胞DR5蛋白表达，DR5表达在AFMC作用6 h后开始增加，先于AFMC和TRAIL两者合用12 h后引起的细胞凋亡率增加（图4A，图5）.
24DR5拮抗性抗体对AFMC增强TRAIL诱导人肺癌A549细胞凋亡作用影响
DR5拮抗性抗体DR5/Fc嵌合蛋白能使亚毒性浓度AFMC和TRAIL合用的A549细胞凋亡率从37.80%±1.78%下降至7.61%± 0.32%（ P<0.05，图6），表明AFMC上调DR5表达是其增敏作用的机制之一.
25AFMC、TRAIL及两者合用对人胚肺WI38细胞的影响
1.0 μmol/L AFMC、30 μg/L TRAIL分别单用或两者联合处理人胚肺WI38细胞，其细胞凋亡率与溶媒组比较，差异均无统计学意义（P>0.05，图1）.AFMC、TRAIL无论单用或合用于WI38细胞24 h，均未呈现凋亡特异性的DNA梯形条带（图3B）.AFMC对WI38细胞DR5表达无明显影响（图4B）.说明：亚毒性浓度的AFMC 对TRAIL诱导凋亡的增敏作用具有肺癌细胞选择性，与其选择性上调肺癌细胞DR5 表达有关.
3讨论
肺癌系全世界最常见的恶性肿瘤之一，全世界每年约有100～130万患者死于肺癌.我国卫生部2008年4月29日公布的第三次全国居民死亡原因调查显示，过去30年间我国肺癌死亡率上升了465%，肺癌已位居我国恶性肿瘤死亡率之首.其中约80%的肺癌患者为非小细胞肺癌（NSCLC），NSCLC发病隐匿，早期不易诊断，确诊时多为中、晚期，已丧失手术良机.目前治疗NSCLC的药物因其非选择性杀伤作用和较强的毒副反应，临床应用受限.临床仍采取以化疗为主的综合治疗，但5年生存率仍低于15%，并且极易复发、转移[11].寻求高效、低毒的新型抗肺癌药物是当前肿瘤防治研究的热点.
TRAIL是1995年发现的与FasL和TNFα有较高同源性的TNF超家族成员.它们都能与靶细胞膜上特异性DR4和DR5受体结合，通过多种死亡信号转导途径诱导靶细胞凋亡.与TNF、FASL不同，TRAIL能选择性诱导肿瘤细胞、转化细胞、病毒感染细胞凋亡，而对肝细胞、骨髓细胞等正常细胞几乎无毒性.大量临床前实验证实TRAIL能有效地诱导多种肿瘤细胞系凋亡 [12].然而随着研究的深入，越来越多的肿瘤细胞尤其是一些恶性肿瘤对TRAIL存在先天性或获得性耐受[2].如何有效逆转肿瘤细胞对TRAIL的凋亡抵抗是当前亟待解决的问题.研究表明，细胞表面DR4和DR5的表达水平是决定肿瘤细胞对TRAIL敏感性的关键，而且在正常37 ℃的生理条件下， TRAIL与其受体结合，DR5的亲和力最强，从而在TRAIL诱导的凋亡通路中发挥最大作用[13].如何上调DR尤其是DR5的表达，增强肿瘤细胞的TRAIL敏感性，充分发挥TRAIL的选择性杀伤效应成为近年研究的热点.
作者前期研究通过细胞毒实验确定了AFMC和TRAIL的亚毒性（细胞毒性<15%）浓度，证实人肺癌A549细胞对TRAIL耐药且AFMC能选择性增强TRAIL对A549细胞毒作用[14].那么，这种细胞毒增敏效应是否通过诱导细胞凋亡实现？本文通过FCM分析和琼脂糖凝胶电泳证明，亚毒性浓度的AFMC与TRAIL联用能协同诱导A549细胞凋亡.文献报道[8]，白杨素能通过上调DR5表达增强TRAIL对多种恶性肿瘤的凋亡诱导作用.前期研究中，作者发现不同浓度AFMC对A549细胞DR4的表达未见明显影响.Western Blotting检测AFMC呈浓度和时间依赖方式上调DR5表达.DR5拮抗性抗体DR5/Fc嵌合蛋白能使AFMC和TRAIL合用的A549细胞凋亡率显著下降.提示DR5的表达上调是AFMC增敏TRAIL诱导A549细胞凋亡的机制之一.前期研究表明AFMC和TRAIL合用对永生化二倍体人胚肺WI38细胞无明显细胞毒性，本文同样证实了两者合用对WI38细胞无明显凋亡诱导作用，且AFMC对WI38细胞DR5表达无影响.综合以上结果作者推测：AFMC选择性增敏TRAIL 诱导人肺癌A549细胞凋亡，与其上调DR5 表达有关.关于AFMC如何上调DR5的具体机制仍有待深入研究和探讨.本文结果可为将天然食源性黄酮化学改造，开发基于TRAIL抗肿瘤治疗提供新途径.
