摘要 目的：观察5烯丙基7二氟甲氧基白杨素（AFMC） ）是否协同肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）诱导人肺腺癌A549细胞凋亡.并探讨其机制是否涉及死亡受体5（DR5）的上调.方法：体外培养人肺腺癌A549细胞和人胚肺WI38细胞.碘化丙啶（PI）染色流式细胞术（FCM）定量分析细胞凋亡率；DNA琼脂糖凝胶电泳观察细胞DNA梯形条带；Western Blotting 检测DR5蛋白表达.结果：单独用亚毒性浓度的AFMC（1.0 μmol/L） 或TRAIL（30 μg/L）处理A549细胞，细胞凋亡率不超过5%.AFMC（1.0 μmol/L）联合TRAIL（30 μg/L）的A549细胞凋亡率增高（37.80%， P<0.01）；而WI38细胞仅有极少量的细胞凋亡（P>0.05）.DNA琼脂糖凝胶电泳显示：两者合用A549细胞呈现典型的DNA梯形条带图谱，而WI38细胞未出现DNA梯形条带；Western Blotting分析发现：AFMC呈浓度和时间依赖性上调A549细胞DR5的表达，DR5特异性抑制剂DR5/Fc嵌合蛋白能有效降低两者合用诱导的A549 细胞凋亡率（P<0.05）.然而，AFMC对WI38细胞DR5表达无明显影响.结论：亚毒性浓度的AFMC选择性增强TRAIL诱导人肺癌A549细胞凋亡.其机制可能与其上调 DR5表达有关.
关键词 肺癌；5烯丙基7二氟甲氧基白杨素；肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体；死亡受体5；细胞凋亡
中图分类号 R966 文献标识码 A 文章编号1000-2537（2014）01-0022-06
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TNFrelated apoptosisinducing ligand，TRAIL） 及其受体（“死亡”受体：DR4和DR5）属于肿瘤坏死因子（TNF）超家族成员，它具有选择性诱导多种肿瘤细胞及转化细胞凋亡，而对正常细胞没有明显细胞毒性的生物学特点，成为了一种极具发展潜力和应用前景的肿瘤靶向治疗因子.但有研究证实，超过50%的肿瘤细胞对TRAIL不敏感[1].庆幸的是，越来越多的实验结果表明TRAIL 与化疗或放疗药物联合治疗能克服大多数肿瘤细胞对TRAIL 的耐受并获得协同杀伤效应[2].
白杨素（5，7二羟基黄酮，ChR）是从多种植物、蜂胶和蜂蜜中提取的一种具有广泛生物活性的天然食源性黄酮.有研究报道指出：白杨素对非小细胞肺癌、恶性胶质瘤、子宫颈癌、白血病、食道鳞癌等多种肿瘤细胞具有良好的抗增殖活性和凋亡诱导作用，而对正常细胞未见明显毒性[3].但由于其肠道吸收甚少且5，7位羟基易被迅速糖基化代谢，导致该化合物的生物利用度降低，体内活性较低，因此，其应用受到限制[4].为此，作者以ChR为先导化合物，通过化学修饰得到ChR类似物5烯丙基7二氟甲氧基白杨素（5allyl7gendifluoromethoxy chrysin，AFMC）.在前期研究中，作者证明AFMC具有较ChR更强的诱导人肝癌HepG2细胞[5]、人卵巢癌CoC1细胞 [6]、人肺癌A549细胞[7]凋亡作用.
Ding等[8]证实白杨素能通过下调cFLIP，上调TRAILR2（DR5）增强TRAIL介导的白血病ATL、乳腺癌MDAMB231、结肠癌HT29、肝细胞癌HepG2、黑色素瘤细胞SKMEL37、胰腺癌Capan1等多种恶性肿瘤细胞凋亡.Jin等[9]报道白杨素类似物柚皮素通过上调DR5增强非小细胞肺癌A549细胞TRAIL耐药株对TRAIL的敏感性.本文研究亚细胞毒浓度的AFMC是否通过上调DR5表达，增强TRAIL诱导的A549细胞凋亡.
1材料和方法
1.1试剂
5烯丙基7二氟甲氧基白杨素（AFMC）按照文献[10]方法合成，分子式：C19O4H14F2；相对分子质量：344，性状：淡黄色晶体；纯度：99.0%.白杨素（ChR）和碘化丙啶（PI）为Sigma公司产品；重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）由PeproTech公司生产；DNA Ladder检测试剂盒购于北京博大泰克公司；重组人DR5/Fc嵌合蛋白购自R&D Systems （Minneapolis，MN）.
1.2细胞培养
人肺癌A549细胞购自武汉大学中国典型培养物保藏中心（中国武汉）；人胚肺WI38细胞购自中国科学院细胞库（中国上海）.在37 ℃、5% CO2（体积分数，下同）及饱合湿度条件下，用含10%小牛血清，1667 mkat/L（即105 U/L）青霉素及1667 mkat/L链霉素的RPMI1640完全培养基传代培养，选取对数生长期细胞用于各项实验.
1.3流式细胞术分析
取对数生长期细胞用含10%小牛血清的培养基处理24 h进行细胞周期同步化后，分别加入含AFMC （1.0 μmol/L）、TRAIL（30 μg/L）以及两者合用的完全培养基孵育24 h；0.2% DMSO作为溶媒对照.收集细胞，加入PBS制备单细胞悬浮液， 再用冷却的PBS冲洗2次， 用70%酒精4 ℃ 固定24 h， PI染色后用流式细胞仪（American BD Company， FACS420）检测细胞凋亡.
1.4DNA琼脂糖凝胶电泳
收集各组细胞，PBS洗涤2次，按照DNA Ladder Detection Kit说明书操作，提取细胞DNA， 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段.
1.5Western Blotting分析
收集不同处理组细胞，PBS洗涤3次，用细胞裂解液（0.1 mol/L NaCl， 0.01 mol/L Triscl（pH 7.6）， 0001 mol/L EDTA（pH 8.0）， 1 mg/L Aprotinin， 100 mg/L PMSF）裂解细胞后提取细胞总蛋白.每组取25 μg蛋白样品进行10% SDSPAGE电泳（100 mA， 3 h），转移至PVDF膜上，用含5%脱脂牛奶的TBST室温下封闭2 h，然后分别加入1∶〖KG-2mm〗1 000稀释的DR5（p48）和βactin一抗，37 ℃孵育2 h；TBST缓冲液洗膜10 min×3次，加入相应的二抗室温孵育1 h后，TBST洗膜3次，每次15 min.ECL化学发光，显影，定影.实验中以βactin作为内参照蛋白.
