1CD45RO+T细胞表型特征
框选TCR基因转染并经肿瘤抗原刺激组中的CD45RO+细胞，CD62L、CD44双荧光抗体染色分析CD45RO+细胞表型。结果显示C45DRO+细胞中主要以CD62L–CD44+表型细胞为主。值得注意的是，随着抗原刺激后时间的延长，CD62L+细胞在CD45RO+细胞中比例逐渐上升。从而使CD62L+CD44+细胞在CD45RO+细胞中的比例逐渐增加，并形成了明显的CD62L+CD44+细胞分群（图3）。
2TCR基因转染与肿瘤抗原刺激促进T细胞肿瘤杀伤活性
将各组效应细胞（PBMC对照组、抗原刺激组、TCR基因转染组、TCR基因转染+抗原刺激组）以不同效靶比（3:1、10:1、30:1）作用于不同肿瘤细胞株。4h后以MTT法检测了各组效应细胞肿瘤杀伤活性。如图4A所示，PBMC组和抗原刺激组在各效靶比对肝癌细胞株HepG-2的肿瘤杀伤活性的差异均无统计学意义（P>0.05）。特异性TCR基因转染后，T细胞的肿瘤杀伤活性上升，在各效靶比与PBMC对照组及抗原刺激组差异均有统计学意义（P<0.001）。值得注意的是，TCR基因转染+抗原刺激组在效靶比10:1和30:1时，肿瘤杀伤活性与TCR基因转染组相比差异有统计学意义（P<0.001）。在各组细胞作用于肝癌细胞株SMMC-7721后也获得了类似的结果（图4B）。TCR基因转染T细胞的杀伤活性在各效靶比与PBMC对照组及抗原刺激组差异均具有统计学意义（P<0.001）。TCR基因转染+抗原刺激组在效靶比10:1和30:1时，肿瘤杀伤活性与TCR基因转染组相比差异有统计学意义（P<0.001）。与作用于肝癌细胞系不同的是，各组效应细胞作用于乳腺癌细胞MCF-7之后（图4C），在各效靶比的肿瘤杀伤活性的差异均无统计学意义（P>0.05）。以上结果提示特异性TCR基因转染可有效促进T细胞识别杀伤抗原阳性肿瘤细胞，并具有良好的抗原特异性。HepG-2的凋亡比例以AnnexinV-PI双染法进一步检测了不同组效应T细胞（PBMC对照组，肿瘤抗原刺激组，TCR基因转染组，TCR基因转染+抗原刺激组）以效靶比30:1作用HepG-2细胞4h后，靶细胞凋亡比例。CD3-PC5荧光抗体染色排除T细胞后，以PI单染为死亡细胞，AnnexinV单染为早期凋亡细胞，AnnexinV-PI双染为晚期凋亡细胞。如图5结果所示。与对照组T细胞相比，靶细胞凋亡比例<1%（图5A），TCR基因转染T细胞作用后，靶细胞凋亡比例上升至18%（图5C）。在TCR基因转染+抗原刺激组T细胞的作用下，靶细胞凋亡比例进一步增加至34.2%（图5D）。
3TCR基因转染与肿瘤抗原刺激影响
T细胞细胞因子分泌为进一步分析T细胞抗肿瘤免疫机制，各组细胞作用于靶细胞HepG-2及SMMC-7721（效靶比30:1）24h后，ELISA法检测了上清中细胞因子含量。
4讨论
特异性TCR基因修饰T细胞为过继性细胞治疗提供了一种靶向性强的治疗策略。在本研究中，我们以之前筛选的肝癌抗原特异性TCR基因为肿瘤抗原识别基因，以改造的嵌合型腺病毒载体Ad5F35-TRAV-TRBV为基因转染工具，对来源于PBMC的T细胞进行了基因修饰。并以肿瘤抗原进一步刺激基因修饰T细胞，观察了经TCR基因转染和抗原刺激后T细胞表型和功能变化。实验结果显示，重组腺病毒Ad5F35-TRAV-TRBV可有效感染T细胞。考虑到腺病毒是一种瞬时转染载体。我们追踪了外源TCR基因转染后在T细胞表达水平的时间变化。结果显示。在腺病毒感染T细胞3d后，外源性TCR基因表达水平最高（接近30%）。随着培养时间的延长，外源TCR基因表达水平逐渐下降。至培养14d后下降至表达高峰的五分之一。在今后实验中，我们拟通过改造启动子[13]，以细核酸病毒核糖体肽取代IRES连接α、β基因[14]、去除糖基化位点等技术改造载体[15]，以进一步提高外源TCR基因的表达水平和稳定性。未经抗原刺激时，无论是否进行TCR基因转染，PBMC中CD45RO+细胞比例始终保持在较低水平。在肿瘤抗原刺激下，T细胞的活化使CD45RO+细胞比例略有上升。这一效果可能是因为来源于健康人供者的多克隆T细胞抗原识别池中部分可识别肿瘤抗原的T细胞发生了活化和扩增。肿瘤特异性TCR基因成功表达于T细胞表面后，有效促进了T细胞识别肿瘤抗原进而充分活化。CD45RO+细胞比例显著高于未转染组刺激后水平。随着抗原刺激后培养时间延长，CD45RO+T细胞比例呈逐渐上升趋势。在刺激后14d接近50%。这一周期与T细胞活医学论文库化后扩增期时间长度一致[16]。
作者：吴凤麟 张文峰 何免 杨暖 薄华本 邵红伟 黄树林
