目前还不清楚Os8N3或Os11N3的激活是如何导致植物感病的。Xoo菌株PXO99A的TALEsPthXo6可激活水稻TFX1基因的表达。TFX1是碱性亮氨酸拉链(bZIP)家族的一员，并可受到多个Xoo菌株的激活，这说明效应蛋白PthXo6在不同Xoo菌株中是保守且非常重要的。敲除OsTFX1基因导致Xoo致病菌株致病能力下降，而水稻组成型表达OsTFX1可恢复Xoo的致病性［9］。AvrBs3诱导的UPA20基因编码碱性螺旋－环－螺旋型转录因子。转录激活UPA20的表达导致在Xcv位点受到感染的细胞变得肥大［7］，细胞的肥大可能在细菌传播至叶表面起到重要作用［26］。但目前尚未完全研究清楚其他参与感病的UPA基因。UPA基因的发现导致发现UPA框，UPA框在发现TALEs的DNA识别机制中起到重要作用，笔者将在下文(1．4)讨论。
1TALEs靶标的抗性机理
黄单胞菌中分离到的多个Ｒ基因，介导TALEs的抗性的图解见图2。由图2可见，TALE经Ⅲ型分泌系统注入植物细胞，番茄NB-LＲＲ类蛋白-Bs4可在植物细胞质识别TALEs，Bs4能够识别全长TALEAvrBs4及缺少核定位信号和酸激活结构域的缺失衍生物。TALE与importinα互作，TALEs转移至细胞核，特异性结合匹配的UPT框，转录激活相应的易感基因(如UPA20，Os8N3，Os-TFIIAg1或OsTFX1)的表达，导致植株感病。激活易感基因可受到ＲNAⅡ聚合酶复合物(红色)突变如xa5(褐色)或单个UPT框突变(xa13突变)的抑制。植株也进化出抗性激活陷阱—正常情况下存在于S基因启动子的UPT框亦存在于Ｒ基因，进而激活Ｒ基因的表达，表现抗病。胡椒Bs3及水稻Xa27基因分别特异性识别AvrBs3和AvrXa27［16－17，21，27－28］。2个Ｒ基因含有效应分子特异的启动子元件，称为UPT框(upregulatedbyTALE)，UPT框直接与相应的TALEs互作，进而激活UPT框下游的基因的表达［5，16］。来自X．gardneri菌株的AvrHah1蛋白与来自Xcv菌株的AvrBs3蛋白中间随机重复结构相似，胡椒Bs3基因不仅能够识别来自Xcv菌株的AvrBs3，同样识别来自X．gardneri菌株的AvrHah1［29］。最新的研究结果表明，与AvrBs3一样，AvrHah1转录激活Bs3基因的启动子［16］。这样，在Bs3和Xa27介导的免疫反应中，Ｒ基因启动子介导TALEs的识别，而Ｒ蛋白仅执行防卫功能。缺少NLS和ADD的TALEs突变体不能激活相应的Ｒ基因［30－31］，因此，转录激活Ｒ基因启动子可能是植物识别TALEs最常见的机理。但来自番茄的Bs4蛋白是唯一例外，Bs4蛋白直接识别AvrBs4的结构，不必受到AvrBs4的转录激活［32－33］，似乎Bs4识别AvrBs4的是结构而不是活性。多数研究结果表明，核苷酸结合位点富含亮氨酸重复(nucleotide-bindingdomain，leucine-richrepeat，NB-LＲＲ)类Ｒ蛋白介导效应分子可激发免疫反应(EffectorTriggeredImmunity，ETI)，这类Ｒ蛋白通过常监控或保卫对植物至关重要的蛋白发挥功能［20，35］，但隐性Ｒ基因很可能为进一步了解TALEs的功能提供有用信息。
2TALEs在生物技术领域应用的前景
2．1广谱抗性基因的人工构建
胡椒Bs3基因能够抗携带AvrBs3的Xcv病原菌;水稻Xa27基因能够抗携带AvrXa27的Xoo病原菌。胡椒Bs3基因与水稻Xa27基因无同源性，但这2个基因均受相应TALEs的转录激活，这说明单子叶植物和双子叶植物具有相同的抗性机理。Ｒomer将AvrBs3、AvrBs3Δrep16与AvrXa27对应的UPT框整合到1个植物启动子中，将这个启动子引入胡椒抗性基因Bs3的上游，结果发现只有病原菌将TALEs注入植物细胞时，才能诱导Bs3基因的表达，植物表现出抗性［16］。目前，水稻白叶枯病与细菌性条斑病是水稻生产的世界性两大重要病害，而取得广谱持久抗性是保证全球粮食安全的重要举措。水稻白叶枯病菌与水稻细菌性条斑病病菌存在大量TALEs，利用TAL密码，可以预测与TALEs相结合的TAL框，不同的TAL框以顺式作用元件的方式与TALEs结合［16］，该结合方式在生物技术领域意义重大，这是由于靶基因可受到不同TALEs的诱导，这些TALEs可在启动子区域与TAL框结合［2］，进而激活相应基因的表达。本实验室采用全基因人工合成的方式获取相应的DNA序列作为水稻抗性基因Xa21和Xa27的启动子，现已成功构建了相应的表达载体并转化水稻，获得了转基因植株，病原菌接种发现转基因水稻表现出较好的抗性，且与非转基因水稻相比转基因水稻的生长发育并未受到明显影响。
2．2TAL核酶促进基因组编辑
锌指蛋白(ZinkFingerProtein)或TALEs能够与限制性内切酶的催化结构域融合形成锌指核酶(zincfingernucleases，ZFNs)或TALE核酶(TALEnucleases，TALENs)，进而在基因组靶位点创造出DNA双链断裂(Double-StrandBreak，DSB)。由于核酶需要形成二聚体发挥功能，则需要构建2个DNA结合蛋白来识别临近的序列，且二聚体之间需要恰当的距离来使核酶催化结构域，形成功能性二聚体裂解靶DNA［36－38］。通过非同源末端连接(non-homologousendjoining，NHEJ)或DNA同源重组(homologousrecombination，HＲ)修复断裂的DNA双链(Double-StrandBreak，DSB)［39－40］。DNA同源重组能够介导内源基因组序列与外源DNA发生核苷酸交换，导致DNA插入、缺失或替换。而NHEJ常造成DSB位点的插入或缺失(insertionsordeletions，indel)造成误义或无义突变来破坏靶基因的功能［41］。诱导DSB的催化结构域常源自ⅡS型限制性内切酶FokⅠ。近几年，学者开展多项研究来增加FokⅠ结构域的内切活性和特异性，发现了超级活性的FokⅠ突变体Sharkey，能够在体内外增加酶切活性［42］;发现了防止形成homodimer的FokⅠ突变体来降低脱靶(off-target)活性［43］。TALENs技术正受到越来越多的关注，在未来可能代替ZFNs技术成为基因定点修饰操作的主要技术(见图3)。图3显示，(a)TAL核酶是TAL效应分子与FokⅠ核酸内切酶结构域的融合子，TAL重复结构域控制DNA结合特异性;(b)2个TAL核酶与邻近的DNA框结合，FokⅠ二聚化诱导2个框之间DNA的断裂。DNA双链的锻炼能促使非同源末端连接(NHEJ)或同源DNA重组(HDＲ)，修饰靶基因组(缺失或插入)。与ZFNs相比，TALENs技术的优势是明显的，第一，TALENs结合DNA的方式更易于预测和人为设计;第二，TALENs的构建更加简便，甚至能够实现大规模、高通量的组装;第三，TALENs结合DNA序列的特异性更强，而毒性和脱靶(off-target)效应则比ZFNs低;第四，ZFNs识别特定碱基序列的三联体核苷酸，这使其应用灵活性降低，为设计和构建针对特定核苷酸序列的ZFNs增加了难度。而且，TALEs可与其他功能性蛋白结构域融合形成新的嵌合体蛋白。通过与转录抑制子结构域融合，TALEs用于形成人工抑制子来抑制细菌［44］、酵母［45］、植物［46］和人［47－48］特定基因的表达。TALEs与整合酶融合对基因组特定位点修饰，与DNA甲基转移酶(methyltransferase)融合，从而实现基因组上特定位点的甲基化，研究表观遗传调控;与组蛋白去乙酰化酶融合来介导染色单体特异的修饰，与胞嘧啶脱氨酶(cytosinedeaminase)融合来进行点突变。由TALEs派生形成的因子具有多种功能，使TALEs成为多面手，应用空间更广阔。近10年来，ZFNs已广泛应用于人和其他模式生物基因组的精确修饰，并已进入临床试验，以治疗糖尿病、神经性疾病、AIDS和恶性脑胶质瘤。TALENs技术已经在基因组定点修饰上取得了成功，甚至在不远的将来有可能代替ZFNs技术。但关于TALEs和TALENs依然还有不少谜团有待揭开。例如:(1)为什么TALEs识别的TAL框5'端紧邻的核苷酸必须是T;(2)为什么TALEs的最后1个识别DNA序列的重复单元只是半个重复单元;(3)TALE对靶位点的结合是否存在核苷酸的偏好性;(4)是否能够优化TALEs单个重复单元的氨基酸序列和长度;(5)TALEs不同的ＲVDs之间是否相互影响;(6)为什么不同的TALENs活性差异如此之大;(7)能否采用更有效的内切酶结构域代替FokⅠ;(8)识别20个碱基序列的TALEN蛋白为1200个氨基酸，如何有效地将TALENs导入组织或细胞中，是通过表达载体还是直接将表达TALENs的mＲNA导入细胞;(9)TALENs对其靶细胞或个体是否具有毒性仍需要进一步的实验验证，目前尚无定论;(10)TALENs是否会导致靶细胞或机体产生免疫反应。
3展望
在完全理解TALEs的功能及潜在利用价值之前，有些疑问仍有待解决:首先，TALEs结合DNA的结构及结构/功能之间的联系问题，这将有助于解释TALEs－DNA结合密码的复杂性;其次，TALEs如何与宿主转录元件互作，TALEs与DNA结合后是否影响内源转录调控子的活性;第三，有关TALEs的进化:TALEs的起源，TALEs的多样性，TALEs可在细菌中重组，为何某些作物的病原菌存在大量TALEs而其他作物并不存在。
作者：吴伦英 景晓辉 沈雁 单位：海南省热带作物资源可持续利用重点实验室 热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室
