近年来，随着生物学与医学的进步，乳腺癌的诊断及治疗已取得较大进展，尤其是乳腺癌相关的特异性分子标志物的研究。乳腺癌根据细胞膜特异性受体，可主要分为三种类型：表达雌激素受体（estrogenreceptor,ER）和/或孕激素受体（progesteronereceptor,PR）的肿瘤、人表皮受体2（humanepidermalgrowthfactorreceptor-2,HER2）异常扩增的肿瘤、ER、PR及HER2阴性表达的肿瘤。其中，部分乳腺癌特异性异常高表达的分子标志物已进入临床研究阶段，甚至在临床上得到运用[1-3]。但乳腺癌的发病率和死亡率仍在女性恶性肿瘤中居第一位[4-5]。因此，迫切需要大量的研究以发现新型乳腺癌生物标志物，用于乳腺癌的早期诊断、临床预后及潜在的治疗靶点。EMP2作为四重跨膜蛋白，具有明显的组织分布特异性，在分泌期的子宫内膜、肺泡上皮细胞及视网膜细胞中呈高表达。EMP2的表达失调与多种肿瘤发生发展相关，如子宫内膜癌、鼻咽癌等，并与患者生存期呈相关性[6-8]。EMP2是目前唯一已知的预测子宫内膜癌上皮增生向恶性肿瘤增生的早期诊断标志物。而在泌尿系统肿瘤中，EMP2作为大豆异黄酮的上调基因，可明显抑制肿瘤生长。此外，可通过与integrinαvβ3作用，进而调节细胞黏附和迁移过程。高表达EMP2的肿瘤具有良好的无进展生存期（P=0.008）和肿瘤相关的死亡（P＜0.01）。表明EMP2可作为在尿路上皮癌的肿瘤抑制基因[9]。早期的研究表明EMP2可能在多种肿瘤中呈现差异较大的表达情况，故而研究EMP2多肿瘤组织表达谱，对于EMP2作为肿瘤特异性分子标志物应用意义较大。故本实验采用多肿瘤组织芯片的方法，高通量的研究EMP2在20种人体常见肿瘤中的表达情况，旨在筛选得到EMP2蛋白在多种肿瘤组织的表达谱，为临床诊断及靶向治疗提供依据。同时，本项目研究表明EMP2在乳腺癌中呈高表达，而在正常乳腺组织中低表达。通过生物信息学预测得到EMP2的抗原肽。体外合成EMP2-KLH多肽后，免疫Balb/c小鼠，进而研究EMP2-KLH多肽免疫对乳腺癌潜在的肿瘤预防及治疗作用。
1材料与方法
1.1免疫组化
EMP2抗体（1:100）用于免疫组化检测组织中EMP2的表达情况。组织芯片(购自陕西超英)经常规脱蜡、水化后，用柠檬酸缓冲液高压修复抗原，自然冷却。随后用3%H2O2于室温避光封闭15min，PBS洗涤后5min×3次后滴加山羊血清，37℃封闭30min；血清封闭后的切片直接孵一抗4℃过夜。第2天从4℃取出切片，PBS洗涤5min×3次，滴加山羊抗小鼠IgG二抗，37℃孵育30min；PBS洗涤5min×3次，滴加辣根过氧化酶标记的三抗，37℃孵育30min；PBS洗涤5min×3次后用DAB显色；流水冲15min，冲洗掉残余的DAB，用苏木素复染1min后，流水冲30min，待返蓝之后，脱水封片，在光学显微镜下观察并采集图像。免疫组化染色结果通过半定量计分的方法进行评价。EMP2的染色强度分布为：阴性（0）、低阳性（1）、中阳性（2）、强阳性（3）。阳性染色的百分比为：<5%(0)、5%~25%(1)、26%~50%(2)、51%~75%(3)、>75%（4）。最终的EMP2的免疫组化染色结果（0~12）为每一患者组织标本的染色强度乘以相对应的阳性染色的百分比。
1.2多肽设计与合成
利用在线软件BepiPred1.0Server从EMP2全蛋白序列直接预测抗原表位，得到相应EMP2抗原肽：DLHQQNRKLYYLLQEGSYGGSGSK。EMP2多肽由上海科肽公司进行合成，并化学偶联到KLH蛋白上，以增强其免疫原性。
1.3动物免疫
Balb/c小鼠购自于北京维通利华生物，MHCHaplotype:H2d，雌性，鼠龄6~8周，体质量约20g，于SPF级动物房饲养。EMP2-KLH多肽首次免疫剂量为10μg/只小鼠，与弗氏完全佐剂研磨混匀后，于背部皮下双点注射，100μL/只。第2、3次免疫分别间隔2周，免疫剂量为10μg/只小鼠，与弗氏不完全佐剂研磨混匀后，于背部皮下双点注射，100μL/只。第3次免疫2周后，取小鼠尾静脉血液备用。另取小鼠免疫前血清作为阴性对照。
1.4ELISA检测
取血后，于37℃血液凝固2h后，4℃放置过夜。当血清自然析出后，4℃，1000×g离心10min，分离血清备用。用50mmol/L碳酸盐包被缓冲液（pH=9.6）溶解EMP2多肽，使抗原浓度为20μg/mL，加100μL/孔于96孔酶标板，4℃放置过夜。次日，弃去包被液后，PBST洗涤3次，每孔加入150μL1%BSA37℃封闭1h。PBST洗涤3次后，每孔加入100μL不同倍比稀释度的血清，并加入对照样品，37℃孵育2h。PBST洗涤5次后，加入100μL稀释后的HRP标记的二抗，37℃孵育1h。PBST洗涤5次后，显色剂显示20min后，酶标仪上读取D（450）值。
1.5动物荷瘤模型
鼠乳腺癌4T1细胞购买于ATCC，MHCHaplotype:H2d。培养基于含10%胎牛血清，100U/mL青霉素和链霉素的DMEM培养基中培养。37℃、5%CO2的孵箱中培养。KLH多肽免疫预防模型：当多肽免疫完成，效价达到预定值后。将免疫后小鼠随机分为4组：生理盐水组、佐剂组、佐剂+KLH组、佐剂+KLH-EMP2多肽组，每组各10只。将对数生长期的4T1细胞进行收集，用无血清DMEM培养基洗涤后，进行细胞计数，调整细胞浓度为5×106/mL，每只小鼠腋下接种100μL。从肿瘤接种后可扪及肿瘤结节开始，每2天用游标卡尺测量肿瘤纵横大小。肿瘤体积计算为：肿瘤体积=长×宽2。同时，记录小鼠体重变化情况和小鼠生存情况。KLH多肽免疫治疗模型：将对数生长期的4T1细胞进行收集，用无血清DMEM培养基洗涤后，进行细胞计数，调整细胞浓度为5×106/mL，每只小鼠腋下接种100μL。将荷瘤小鼠随机分为4组：生理盐水组、佐剂组、佐剂+KLH组、佐剂+KLH-EMP2多肽组，每组各10只。分别于接种肿瘤后第5天、第12天、第19天免疫小鼠。从肿瘤接种后可扪及肿瘤结节开始，每2天用游标卡尺测量肿瘤纵横大小。肿瘤体积计算为：肿瘤体积=长×宽2。同时，记录小鼠体重变化情况和小鼠生存情况。采用GraphPad5.0软件。数据均以均数±标准差（Mean±SD）表示，进行单因素方差分析，组间比较采用t检验。
2结果
2.1EMP2在乳腺癌组织中呈高表达
EMP2在正常乳腺、甲状腺以及子宫颈等正常组织中呈低表达，而在前列腺、肝、胰腺、肺、肾等正常组织中呈高表达。与相对应正常组织比较，EMP2在乳腺癌（P=0.02）、卵巢癌（P=0.03）、宫颈癌（P＜0.01）、膀胱癌（P=0.001）、甲状腺癌（P＜0.01）、皮肤癌（P＜0.01）等肿瘤中明显高表达，而在胰腺癌（P＜0.01）、前列腺癌（P＜0.01）、肺癌（P=0.002）、肝癌（P=0.003）及脑部肿瘤（P＜0.01）中呈低表达或阴性表达（图1、2）。
2.2EMP2-KLH多肽免疫具有明显的乳腺癌预防效果
KLH-EMP2多肽免疫完成后，ELISA检测血清中EMP2抗体效价，当免疫血清D（450）/阴性对照血清D（450）(P/N)＞2.1时，判断为阳性(+)。经计算，EMP2多肽免疫后效价为＞1:12800，满足肿瘤免疫需求（表1）。小鼠EMP2-KLH多肽免疫后，可明显抑制4T1荷瘤动物模型中肿瘤的生长（图3）。同时，显著延长小鼠的生存期（图4），而EMP2-KLH多肽免疫对于小鼠的体重无明显影响（图5）。2.3EMP2-KLH具有明显的乳腺癌治疗效果在小鼠乳腺癌细胞4T1荷瘤动物模型中，EMP2-KLH多肽免疫治疗能明显抑制肿瘤的生长（图7、8）。同时，EMP2-KLH多肽免疫治疗显著延长小鼠的生存期（图9）。
3讨论
在中国，过去30年中，女性癌症中乳腺癌的发病率和死亡率居首位并呈上升趋势[10,11]。尽管乳腺癌的治疗已取得较大的进步，乳腺癌仍然是最常见的预后较差的恶性肿瘤之一[12]。新型诊断与治疗手段可以帮助临床医生针对乳腺癌的复发和恶化的情况确定相应的诊疗技术，以提高患者的生存质量[13,14]。同时，在子宫内膜癌及视网膜上皮细胞中，EMP2可诱导VEGF的表达，进而促进细胞的增殖过程[15,16]。现有研究表明EMP2可与integrins及P2X7相互作用，进而调节肿瘤生长及转移等过程，进而影响患者生存期。与正常卵巢组织相比，EMP2在超过70%的卵巢癌中呈高表达，anti-EMP2抗体治疗明显抑制卵巢癌细胞生长、诱导细胞凋亡[17]。在胶质瘤中，95%的患者高表达EMP2蛋白，而在正常脑组织中EMP2呈无表达或阴性。EMP2通过上调integrinαvβ3表达、激活focaladhesionkinase（FAK）及Src激酶，进而加速肿瘤生长，促进肿瘤转移[18]。动物实验研究同样表明，anti-EMP2抗体治疗胶质瘤取得良好的肿瘤治疗效果[19]。大量的研究表明，EMP2在多种肿瘤中呈高表达，如子宫内膜癌、卵巢癌、宫颈癌等，并与病人生存期呈正相关。通过调节integrins及VEGF表达、激活FAK及Src激酶，进而加速肿瘤生长，促进肿瘤转移，在肿瘤中发挥癌基因相关作用[6-8,15,18,19]。但同时，部分研究表明在部分肿瘤如泌尿系统肿瘤、肺癌中能显著抑制肿瘤转移，与肿瘤患者生存期呈负相关[19]。表明EMP2可能具有组织表达特异性，在不同肿瘤组织中具有不同的生物学功能，并受多种可能因素的调节。在本实验中，我们利用多肿瘤组织芯片，高通量的研究EMP2在20种不同肿瘤组织中的表达情况，旨在构建相应的组织表达谱，为EMP2分子诊断或生物靶向治疗提供相应的理论依据。我们发现，EMP2在前列腺、肝、胰腺、肾等正常组织中呈高表达。与相应正常组织比较，EMP2在乳腺癌、宫颈癌、膀胱癌、甲状腺癌等肿瘤中明显高表达，而在胰腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌及脑部肿瘤中呈低表达或阴性表达。表明EMP2可能在不同的肿瘤组织类型中具有不同的生物学功能。其中，乳腺癌较之正常乳腺组织，EMP2表达差异较大，表明EMP2在乳腺癌中具有潜在的诊断价值和可作为新型的治疗靶点。同时，我们发现，在EMP2上调的肿瘤类型中，其恶性程度和致死率明显低于EMP2下调的肿瘤类型[5]。故EMP2在不同的肿瘤类型可能存在不同的分子层面的调控，如基因突变，基因表观遗传学修饰，蛋白泛素化降解，甚至肿瘤微环境的调控，均可能会影响EMP2蛋白的表达水平，并对肿瘤功能进行调控。我们后期拟开展相应的研究，对EMP2在肿瘤调控功能及机制进行相应的研究。
目前,基于肿瘤靶点的抗体治疗已逐渐成为肿瘤治疗的一线治疗策略。针对EGFR的西妥昔单抗(Cetuximab)、针对CD20的利妥昔单抗(Rituximab)、针对VEGF的贝伐单抗(Bevacizumab)、针对HER2的曲妥珠单抗(Trastuzumab)及针对CTLA-4的伊匹单抗(Ipilimumab)等抗体药物用于多种临床肿瘤的治疗，并取得良好的临床治疗效果[20]。同时,随着新型抗体不断研发,例如针对PD-1分子的MDX-1106和BMS-936558均已进入临床试验阶段,使得抗体治疗成为目前肿瘤治疗的研究热点。但如何发现有效的新型临床治疗靶点仍然困扰着肿瘤生物治疗的药物研发的最大难题。靶向EMP2的抗体治疗可明显抑制肿瘤的生长，同时，生物安全性评估表明靶向EMP2的抗体治疗对于正常组织无毒副作用，对小鼠体重及肝脏功能均无明显的影响[17,21]。表明EMP2靶向治疗具有良好的应用前景。近年来，大量的关于乳腺癌的疫苗进行研发，其中部分已进入相应的临床实验阶段[1,22,23]。多肽疫苗与传统疫苗相比，多肽疫苗多来源于化学合成，具有成本较高，不易大规模制备等缺点。但同时，具有易于合成纯化、可诱导高特异性的免疫应答、无潜在的生物安全等优势，故而受到越来越多的重视。本实验中，针对乳腺癌EMP2构建相应的EMP2蛋白多肽疫苗，并在小鼠荷瘤模型上验证其对乳腺癌的免疫预防及治疗作用[24]。我们发现EMP2蛋白多肽疫苗免疫可明显抑制小鼠乳腺癌细胞的生长，并延长荷瘤小鼠的生存期。同时，EMP2多肽对荷瘤小鼠的肿瘤生长具有良好的抑制效果，进而延长荷瘤小鼠的生存时间。表明EMP2多肽具有较好的肿瘤预防及治疗效果。EMP2可作为乳腺癌生物治疗的靶点，具有潜在临床运用价值。
作者：许颖 吴东明 石娇 杜红飞 周晓萍 王丹 单位：成都医学院第一附属医院检验科
