1鱼体宰后贮藏过程中发生水解的主要肌原纤维蛋白
肌肉主要是由肌原纤维蛋白构成的，鱼类中的肌原纤维蛋白含量（占总蛋白含量的60%-80%）比哺乳动物（40%）高。在宰后鱼肉的低温贮藏过程中，肌原纤维和细胞外基质中的关键结构蛋白以及在肌原纤维和肌原纤维膜间起连接作用的蛋白质会发生降解[16]，将对肉的硬度、风味等品质产生重要影响。肽链内切酶会显著影响鱼肉的质地，而外肽酶能通过作用于风味变化相关的多肽类物质对鱼肉的风味等品质产生影响[17]。鱼体宰后的低温贮藏过程中会发生水解的肌原纤维蛋白主要包括肌球蛋白、肌动蛋白、肌联蛋白、伴肌动蛋白、原肌球蛋白、肌钙蛋白等。肌球蛋白参与肌肉收缩，其分子质量为500ku，是一个不对称的六聚体蛋白，含有多个结构域和功能域。肌动蛋白是肌原纤维中参与肌肉收缩的另一种蛋白质，是分子质量为43ku的球形蛋白。肌联蛋白是肌原纤维中含量占第三位的蛋白质，是目前已发现的最大蛋白质，分子质量大约为3000ku，在横纹肌细胞中至少有两个功能，即作为粗肌丝装配的模版以及结合到Z线的α-辅肌动蛋白上来连接粗肌丝和Z线。伴肌动蛋白是分子质量约为700ku的可调节肌动蛋白长度的重要蛋白质。原肌球蛋白是细肌丝上的一种二聚体蛋白。肌钙蛋白由三种亚基构成，这三种成分都能发挥其各自特定的功能，其中，肌钙蛋白T能提供肌钙蛋白和原肌球蛋白的结合，肌钙蛋白C能特异性结合Ca2+，肌钙蛋白I能抑制肌动球蛋白中的ATP酶活性。
2能量代谢的相关酶——ATP酶和乳酸脱氢酶
2.1ATP酶
ATP酶主要以Na+,K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶、Ca2+,Mg2+-ATP酶４种形式存在于组织细胞膜及细胞器膜上，它在物质运输、能量代谢、离子平衡以及信息传递等方面发挥重要作用。其中，Na+,K+-ATP酶是主动运输的特殊运载酶，能催化水解ATP并驱动Na+和K+在生物膜两侧的对向运输[18-20]。宰后鱼肉ATP的快速降解与高活性的ATP酶有关，Watabe认为，在低温贮藏下鱼类肌浆网状结构的钙吸收能力降低，肌浆纤维内钙离子浓度增加，而钙离子能激活Mg2+-ATP酶，使ATP快速降解[21,22]。因此，ATP酶活力的大小是评价细胞能量代谢的重要指标[23]。低温贮藏过程中冰晶引起的三级结构的改变、体系离子强度的增加以及蛋白质重排可能会导致ATP酶活性的改变[24]。Na+,K+-ATP酶活性的变化能有效地反映细胞的功能和结构性状，已成为研究鱼类毒性的重要指标；Ca2+,Mg2+-ATP酶的活性是反映外源性钙离子存在下肌动蛋白—肌球蛋白复合物完整性的重要参数；Mg2+-ATP酶的活性能表征肌动蛋白的完整性；Ca2+-ATP酶的活性能表征肌球蛋白的完整性[2,25]。因此，ATP酶活力的大小也是影响肌肉收缩张力和收缩速率的重要因素。同时，鱼肉肌球蛋白头部具有Ca2+-ATP酶活性，是反映鱼肉或鱼糜蛋白变性的常用指标，而蛋白质的变性程度又往往与鱼肉品质有密切关联[26,27]。鱼肉中的ATP在贮藏过程中由于ATP酶的作用降解为腺苷二磷酸(adenosinediphosphate,ADP)，随后在多种酶的连续催化下依次降解为腺苷酸(adenylicacid,AMP)、肌苷酸(inosinicacid,IMP)、次黄嘌呤核苷(hypoxanthineriboside,HxR)和次黄嘌呤(hypoxanthine,Hx)[22]。对于大部分宰后鱼肉而言，ATP的最初分解代谢通常导致IMP的暂时快速积累，使鱼肉产生良好风味，然后这种物质再慢慢降解为HxR，进而降解为Hx，而Hx被认为是引起异味的物质，随着贮藏时间的延长，Hx含量迅速上升，最终导致鱼体腐败味的产生[11]。因此，ATP酶活性可以作为判断鱼肉风味等品质的最佳指标之一。目前，分离纯化ATP酶主要采用亲和层析法，此法操作过程简单、对于微量样品的纯化效率高、活性物质回收率高、特异性强、操作条件温和并能保持ATP酶在分离纯化过程中的生物活性，且能用于分离纯化含量极少且稳定性不高的活性物质[28]，但此法所用试剂价格昂贵。例如有研究报道可采用反应红-120琼脂糖(reactivered-120agrose)亲和层析法分离纯化Ca2+-ATP酶，其基本原理是利用Ca2+-ATP酶与染料（反应红）之间的亲和作用进行分离[29]。另外，也可采用梯度离心分离纯化Ca2+-ATP酶，但这种方法不仅耗时长而且活性物质纯度不高。国外的文献也指出可采用凝胶电泳法或氯仿/甲醇提取结合色层分析的方法进行分离纯化，采用前者的纯化方法纯度可达到95%以上[30,31]。将肌肉组织制成粗提酶液进行ATP酶活性的测定，可通过酶促反应释放的无机磷含量或ATP的减少量及pH值的改变来测定。目前国内外最常用的方法是通过无机磷含量测定，该方法的基本原理是ATP酶可将ATP分解成ADP和无机磷，通过测定无机磷的含量来间接测定ATP酶的活力[23]。无机磷的测定常采用硫酸亚铁磷钼蓝显色法，其原理是无机磷能与钼酸铵在酸性条件下反应并生成磷钼杂多酸，磷钼杂多酸被还原剂硫酸亚铁还原后生成蓝色的磷亚钼酸复合物（磷钼蓝），采用比色法进行测定，目前该方法已有试剂盒可用，Na+,K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶、Ca2+,Mg2+-ATP酶的活性均可准确测定，此法显色稳定、特异性强、线性范围较宽，但灵敏度较低、还原剂不稳定，且需要除去蛋白；另外也可通过孔雀绿单一试剂显色法测定无机磷含量，此法可以不去除蛋白直接测定，但显色时间较长[32]。新鲜鱼肉中ATP酶的活性较高，但随着冷藏时间的延长其活性明显下降且其下降趋势符合KarlPearson直线关系式，呈现负相关（P0.01）。此外，宰后鱼肉经过冷藏后TBA值明显升高，与ATP酶活性明显下降存在显著相关性[7]。有研究结果显示：罗非鱼片在冷藏1-2d内，Ca2+-ATP酶活性明显下降，在第二天活性为1.847μmolPi/(hmg蛋白)，下降了22.61%，在第十三天活性为1.056μmolPi/(hmg蛋白)，下降了55.74%，之后随着冷藏时间延长其活性下降缓慢，并且酶活性变化与挥发性盐基氮值和K值等品质指标有良好的相关性[33]。还有报道指出：罗非鱼鱼糜在新鲜状态时的Ca2+-ATP酶活性为4.8μmolPi/(hmg蛋白)，鳙鱼鱼糜为10.2μmolPi/(hmg蛋白)，在-18℃冻藏期间罗非鱼鱼糜在0-21d内酶活性显著降低（P0.05），在21-49d内下降不显著（P0.05），而鳙鱼鱼糜在整个冻藏期间酶活性均显著降低（P0.05），在63d后罗非鱼和鳙鱼鱼糜酶活性分别下降了100%和43.5%[32]，表明不同鱼肉种类之间酶的活性也存在显著差异。
2.2乳酸脱氢酶
乳酸脱氢酶是能量代谢中参与糖酵解的一种主要酶，它以NAD+为辅酶，可逆地催化丙酮酸和NADH与乳酸和NAD+之间的反应，因此又称为L-乳酸：NAD+氧化还原酶[34]。乳酸脱氢酶是一组由“M”和“H”两种亚基类型组成的四聚体同工酶，这两种亚基是被不同的基因编码并且结合形成五种同工酶—HHHH、HHHM、HHMM、HMMM和MMMM（分别指LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5），第六种同工酶LDHX被证实存在于睾丸中，并且被认为是一个第三基因座的产物[35]。LDH1和LDH2主要存在于心脏中，有助于实现从乳酸到丙酮酸的转化；而LDH4和LDH5主要存在于肝脏和骨骼肌中，有助于逆反应生成乳酸[36]，完成糖酵解过程，为机体在缺氧条件下提供能量[37]。乳酸脱氢酶催化的丙酮酸与乳酸之间的可逆反应的速率决定于介质中的pH值，且这种决定作用对于正逆反应是不同的[38]。pH值的改变能影响酶活性中心上必需基团及底物和辅酶的解离程度，从而影响酶与底物的结合和催化特性。乳酸脱氢酶作为糖酵解的末端酶，其活性的改变将直接影响到机体的能量代谢[8]。另外，研究发现鱼体在冷藏过程中其硫代巴比妥酸(thibarbituricacid,TBA)值、过氧化值等与乳酸脱氢酶的活力存在相关性，因此，乳酸脱氢酶也可作为衡量鱼肉早期变质程度的一个指标。乳酸脱氢酶的分离纯化常采用亲和层析法，原理是利用酶与载体之间的特异性作用，该法效率高，但成本高且操作较繁琐。也有其他分离纯化方法的相关报道，例如L.Marchat等利用离子交换层析柱、羟磷灰石吸附剂和SuperdexHr-200纯化出了丝虫Molinemadessetae的LDH1和LDH2同工酶[37,39]。另外，也可采用淀粉凝胶电泳法（垂直淀粉凝胶电泳分离LDH1和LDH2同工酶；水平淀粉凝胶电泳分离LDH3和LDH4同工酶）[34,35]或硫酸铵沉淀、离子交换层析和疏水层析的混合方法进行高效纯化，此混合方法能得到比活力和得率都较高的LDH。乳酸脱氢酶的等电点在5.0附近，其最适pH值为6.5，因此乳酸脱氢酶带负电荷，可用二乙胺基乙基纤维素(diethylaminoethylcellulose,DEAE)阴离子交换剂进行纯化分离；同时，乳酸脱氢酶疏水力较强，故可采用疏水层析进一步分离纯化[40,41]。乳酸脱氢酶活性的测定方法有多种，目前较多采用分光光度法。乳酸脱氢酶测试盒法即是基于分光光度法的原理，通过乳酸脱氢酶催化底物反应产生丙酮酸，然后与2,4-二硝基苯肼显色剂反应，生成的腙类化合物在碱性溶液中呈现红棕色，再通过比色可求得酶活力[8]；或者利用NADH在340nm处有最大吸收峰，而NAD+没有吸收峰，因此可以通过NADH的减少或增加量即通过检测340nm处吸收峰值的变化值来间接定量乳酸脱氢酶的活性[42]；也可以利用NADH与吩嗪硫酸甲酯和硝基四唑蓝进行反应生成甲臜，通过测定甲臜的吸光度值来间接测定酶活力。另外Keyhani等利用铁氰化钾在420nm处有吸收峰间接测定出了藏红花茎中的乳酸脱氢酶活力[43]。分光光度法操作简单、快速，但选择性较差，也不适用于有颜色样品的测定[44]。除了使用分光光度法外，也有使用手工目测法和丙酮酸氧化酶电极、修饰了亚甲基绿的碳纤维电极或示差脉冲伏安法等基于电化学方法的相关报道，电化学方法具有灵敏度高、稳定性好、选择性强、不易受到介质颜色的干扰等优点，例如采用电流法的检测限达10U/mL，线性范围为15-240U/mL[45]，但制备有效电极过程较为繁琐。另外，也可利用NADH本身具有荧光特性（最大激发波长为350nm，最大发射波长为460nm），从而利用荧光强度变化直接定量乳酸脱氢酶的活性，有研究结果显示：当NADH浓度在50-300mol/L范围时其荧光强度与浓度呈较好的线性关系[45]。采用荧光法灵敏度要远高于紫外分光光度法，且该法适用于微量样品中酶活性的测定，但是由于早期荧光分光光度计价格昂贵未得到普及，国内外文献中有关用荧光法测定乳酸脱氢酶活性的报道极少，方法尚不够成熟。新鲜鱼肉中乳酸脱氢酶的活性较高，但随着冷藏时间的延长其活性明显下降，呈现负相关（P0.01）。此外，宰后鱼肉经过冷藏后TBA值明显升高，与乳酸脱氢酶活性明显下降存在显著相关性[7]。
3骨骼肌蛋白降解的相关酶——钙激活蛋白酶和溶酶体组织蛋白酶
3.1钙激活蛋白酶
钙激活蛋白酶（又称钙激活因子、钙激活酶、依钙蛋白酶、钙激活中性蛋白酶）[46]是一个半胱氨酸蛋白酶家族。至今已鉴定出14个成员，在骨骼肌中主要由μ-钙蛋白酶、m-钙蛋白酶、钙蛋白酶3(calpain3,p94)、钙蛋白酶抑制蛋白和钙蛋白酶激活蛋白组成[5]。除激活时需要的钙离子浓度不同以及结构略有差异外，μ-钙蛋白酶和m-钙蛋白酶类似，均由80ku的具有催化活性的大亚基和30ku的具有调节活性的小亚基构成。被Ca2+激活的机理大致分为以下4个过程：大、小亚基发生分离；30ku的小亚基自溶降解为17ku；80ku的大亚基自溶经78ku再降解为76ku；酶构象发生变化而表现水解蛋白的活性。钙激活蛋白酶作为一个酶原，自溶是其发挥降解作用的前提，活性下降是其发挥降解作用的标志。p94由于在提取时不稳定，极易失去活性，因此目前还没证实它与鱼肉硬度的关系，但是它能结合到肌联蛋白的N2线位点上，此位点的水解与肉的嫩化有关，并且有迹象表明它和肌纤维代谢活性有关，因此近年来引起了肉类学家的广泛关注[47]。钙蛋白酶抑制蛋白是细胞内高效专一性抑制钙激活蛋白酶活性的蛋白质，它能识别钙激活蛋白酶与钙结合引起的构象变化，并与之特异性结合，保证对底物只进行局部特定位点的水解，这种抑制作用不受pH值影响。钙蛋白酶激活蛋白作为另一种钙激活蛋白酶调节因子，是一个分子质量为30ku的热稳定二聚体。它能显著提高钙激活蛋白酶的活性并减弱钙蛋白酶抑制蛋白的抑制作用。目前发现有2种类型，一种是UK114，是μ-钙蛋白酶的激活因子；另一种是酰基辅酶A结合蛋白(acyl-CoA-bindingprotein,ACBP)，是m-钙蛋白酶的激活因子[46]。目前有关钙蛋白酶激活蛋白的研究正在兴起，国内相关研究较少[1]。钙激活蛋白酶可能参与肌原纤维解装配成肌丝的过程，控制骨架蛋白和肌原纤维蛋白的降解，是蛋白质水解过程的限速步骤[48]。僵直后的成熟嫩化过程最重要的是Z盘的崩解，已经证实蛋白水解酶特别是钙激活蛋白酶参与了这一过程，它通过肌联蛋白的断裂引发Z线的断裂，弱化了肌联蛋白与α-辅肌动蛋白之间的相互作用，并且导致了完整的α-辅肌动蛋白从肌纤维结构中释放。宰后鱼肉中钙激活蛋白酶活性受到多种因素的影响，如pH下降速率、最终pH值、贮藏温度、初始钙蛋白酶抑制蛋白含量等[17]。鱼体宰后，随着ATP的消耗和pH值下降，细胞膜的完整性破坏，释放肌质网肌小泡内积蓄的钙离子，钙激活蛋白酶被活化而后发生自溶[49]。自溶能降低钙激活蛋白酶对Ca2+的依赖性[50]。一些研究表明是μ-钙蛋白酶而不是m-钙蛋白酶影响死后贮藏过程中鱼肉的硬度，因为研究结果显示：在贮藏过程中μ-钙蛋白酶发生了快速的自溶，而m-钙蛋白酶却相当稳定[51]。目前，一些研究人员对关于钙激活蛋白酶是造成肌肉嫩化的主要蛋白水解酶存在以下几点争论：（1）钙蛋白酶抑制蛋白的含量是μ-钙蛋白酶的两倍，且鱼体中的钙离子浓度达不到理论上激活钙激活蛋白酶所需的浓度，那么钙激活蛋白酶是如何被激活的，且被激活后又由于自溶作用而很快失活了，其如何发挥水解作用。（2）钙激活蛋白酶正调节因子（钙蛋白酶激活蛋白）是如何调控钙激活蛋白酶活性的。（3）p94的作用机理尚不明确[52]。也有部分研究者提出游离钙离子自身能通过非酶作用参与肌肉嫩化，如Shimada和Takahashi等人指出钙离子通过与磷脂直接结合参与Z盘的崩解，但是他们也没有完全排除一种未知蛋白酶参与这种限制性蛋白水解的可能性。然而大量的研究表明，只能由钙激活蛋白酶系提供肌丝降解所需要的特殊剪切，但它可能参与调节蛋白质的周转代谢，而非整个蛋白降解过程的直接参与者。另外，有研究指出，当有钙激活蛋白酶抑制剂或乙二醇二乙醚二胺四乙酸(ethyleneglycoltetraaceticacid,EGTA)等钙离子络合剂存在时，仍然有部分肌原纤维蛋白可以发生降解。这些都可以推测除了钙激活蛋白酶系外还可能存在其他的内源性酶类参与了肌肉嫩化过程[53]。钙激活蛋白酶可能通过对肌原纤维蛋白进行局部的特异性降解而对其结构和功能进行调控，即首先攻击肌原纤维的肌节部位，释放肌丝使降解为小片段，然后被溶酶体捕获并进一步降解。目前钙激活蛋白酶有两种较为普遍的分离纯化方法，即疏水层析法和离子交换层析法[46]。有报道指出，通过疏水层析法和随后进行的阴离子交换层析法能成功地将钙蛋白酶抑制蛋白从钙激活蛋白酶中分离出来，同时分离出μ-钙蛋白酶和m-钙蛋白酶两种形式[54]。国外也有文献报道，可采用快速蛋白液相层析法(fastproteinliquidchromatography,FPLC)用DEAE柱分离纯化钙激活蛋白酶[17]；另外也有研究指出可采用DEAE-SepharoseF.F.代替DEAE-Sephacel来缩短洗脱时间，达到更快速的μ-钙蛋白酶、m-钙蛋白酶和钙蛋白酶抑制蛋白分离[55]。钙激活蛋白酶活性测定可通过酪蛋白酶谱法，另外此法还可以用于分离发生自溶和未自溶的酶[56]。也可采用酪蛋白作为底物，设置加入氯化钙溶液或EGTA钙离子络合剂两个实验组，再通过紫外分光光度法在278nm处测定吸光度变化值或考马斯亮蓝法在595nm处测定吸光度变化值来测定酪蛋白含量进而间接测定钙激活蛋白酶的活性[57]，此法操作简单、成本低，但灵敏度相对较低。另外，也可使用琥珀酰-亮氨酸-酪氨酸-7-酰胺基-4-甲基香豆素(N-succinyl-leucine-tyrosine-7-amino-4-methylcoumarin,Suc-Leu-Tyr-AMC)作为底物，加入3-[3-(胆酰胺丙基)-二乙胺]-1-丙磺酸(3-[3-(cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propanesulphonate,CHAPS），在355nm的激发波长和460nm的发射波长下通过测定酶水解上述底物释放出的酰氨甲基香豆素(7-amino-4-methylcoumarin,AMC)的荧光值来测定钙蛋白酶活性[58]，荧光法的灵敏度高于紫外分光光度法，且适用于微量样品的测定，但相比于酪蛋白，此法使用的底物Suc-Leu-Tyr-AMC并不是钙激活蛋白酶的良好底物[59]。钙激活蛋白酶在新鲜状态时具有较高活性，测得的黑鲈白肉中的活性为1308261FU/(ming)，钙蛋白酶抑制蛋白活性为224444021FU/(ming)，钙蛋白酶抑制蛋白与钙激活蛋白酶的比率为17.2[13]。有研究结果显示：随着贮藏时间的延长钙激活蛋白酶活性逐渐下降，当牦牛肉成熟第八天时其活性仅为刚屠宰时的27%；另外，发现反映肌原纤维蛋白降解和结构破坏程度的肌原纤维小片化指数与钙激活蛋白酶活性呈显著性相关（P0.01）[14]。在钙激活蛋白酶系中，μ-钙蛋白酶活性随贮藏时间下降最显著，钙蛋白酶抑制蛋白次之，而m-钙蛋白酶活性变化最不显著[46]。
3.2溶酶体组织蛋白酶
已知的溶酶体组织蛋白酶大约有16种，根据作用位点的不同可分为4类：半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、金属酵素蛋白酶[60]。目前已从骨骼肌中分离到8种组织蛋白酶，它们是A、B1、B2（溶酶体羧肽酶B）、C、D、E、H和L[55]。其中，B、D、H、L是肌肉中主要的组织蛋白酶。除了组织蛋白酶D外，其余三种都是半胱氨酸内切酶。组织蛋白酶大多属于酸性蛋白酶，组织蛋白酶B、D、H、L的适宜pH范围分别为3.0-6.0、2.8-4.0、5.0-7.0、3.0-6.0，但在水解时却表现出更宽的活性范围[61]。组织蛋白酶B是一个分子质量为30ku的双叶形硫醇蛋白酶，兼有内肽酶及羧肽酶活性[62]，通过左叶的半胱氨酸残基（C29）和右叶的组氨酸残基（H199）的相互作用催化肽键的断裂[63]。组织蛋白酶D是一种天冬氨酸蛋白酶，分子质量为43-53ku，是一种酸性糖蛋白，在粗面内质网中作为酶原被合成。它是唯一能在pH6以下有活性且不需要还原环境的溶酶体酶。单独的组织蛋白酶D水解活性较弱，但与组织蛋白酶A一起能显著提高其水解作用，推测可能是组织蛋白酶A能进一步水解组织蛋白酶D降解后的肽链产物[64,65]。研究指出组织蛋白酶D在肌原纤维降解和肌肉的嫩化中起到了重要作用，并且在宰后肉的解僵成熟过程中产生了风味物质[66]。组织蛋白酶H的分子质量为26-28ku，兼有硫醇内切酶和氨肽酶活性。它能以内肽酶的作用方式水解鱼精蛋白，以氨肽酶的作用方式水解三肽和四肽。目前关于鱼类中组织蛋白酶H降解肌原纤维蛋白的研究报道较少，这可能是因为酶粗提液中组织蛋白酶H的内肽酶活性远低于组织蛋白酶B和L；另外酶粗提液中存在的部分氨肽酶也使得其活性难于准确测定[67]。组织蛋白酶L和组织蛋白酶B分子质量类似且也属于硫醇蛋白酶[68]。目前的研究表明组织蛋白酶L降解肌球蛋白的活性比B高10倍，组织蛋白酶H比B高5倍，组织蛋白酶D比B高2-3倍。Matsukura等人发现组织蛋白酶L对肌动蛋白的降解比肌球蛋白慢。近来，发现大西洋鲑鱼鱼片的硬度与组织蛋白酶L的活性呈现显著的负相关[51]。Yamashita和Konagaya表明由于组织蛋白酶L对三文鱼肌肉结构蛋白的水解多于组织蛋白酶B，并且由于其底物水解的专一性，指出组织蛋白酶L是最可能参与肌肉软化过程中的酶[69,70]。组织蛋白酶B、H、L在活的有机体内被半胱氨酸蛋白酶抑制剂调节控制[71]，通常活性不高，但是在死后肌肉的冷藏和解冻过程中会释放出来[5]。组织蛋白酶在体内主要以酶原形式存在，其激活是通过蛋白水解酶切除部分肽链实现的[10]。不同的组织蛋白酶具有不同的水解特异性。组织蛋白酶B水解肌球蛋白重链、肌钙蛋白T，并且会缓慢降解肌钙蛋白I和原肌球蛋白；组织蛋白酶D能降解肌球蛋白、肌动蛋白、肌联蛋白；组织蛋白酶H主要降解肌钙蛋白T；组织蛋白酶L降解除了肌钙蛋白C和原肌球蛋白以外的大部分肌原纤维蛋白[72]。目前，一些学者认为肌肉在宰后贮藏过程中蛋白质的降解是分步进行的，首先钙激活蛋白酶进行初步降解，然后溶酶体组织蛋白酶进一步降解，两者协同完成肉的嫩化[10]。溶酶体组织蛋白酶分离纯化的关键就是要除去细胞中的钙激活蛋白酶，一般采用亲和层析法提取。文献指出还可经粗酶液提取、酸处理、硫酸铵分级沉淀、DEAE-SepharoseF.F.离子交换层析和SephacrylS-100凝胶过滤层析等步骤进行其分离纯化[67]。国内外测定溶酶体组织蛋白酶活性的方法大致相似，仅在底物的选择和某些操作过程细节方面存在一些差异。其中组织蛋白酶B、B+L、H的活性大多采用灵敏度较高的荧光分析法，可分别以N-苄酯基-精氨酸-精氨酸-7-酰胺基-4-甲基香豆素(Z-arginine-arginine-7-amino-4-methylcoumarin,Z-RR-AMC)、N-苄酯基-苯丙氨酸-精氨酸-7-酰胺基-4-甲基香豆素(Z-phenylalanine-arginine-7-amino-4-methylcoumarin,Z-FR-AMC)、N-苄酯基-精氨酸-7-酰胺基-4-甲基香豆素(L-arginine-7-amino-4-methylcoumarin,R-AMC)作为底物，在37℃和pH分别为6.0、6.0、6.8的条件下反应，在355nm的激发波长和460nm的发射波长下通过测定酶水解上述底物释放出AMC产物的荧光值来测定酶的活力[61,73,74]。其中，在测定组织蛋白酶H的活性时，由于氨肽酶的影响，需向反应体系中加入半胱氨酸蛋白酶的专一不可逆抑制剂—反式环琥珀酰-亮氨酰氨-胍基丁酮(transringsuccinyl-brightammoniaamido-guanidinebutanone,E-64)，通过测定降低的活性间接求出组织蛋白酶H的活性。也有报道指出可以采用偶氮酪蛋白的变异型（变体）作为底物测定组织蛋白酶L的活性，而且此底物目前也广泛使用，但从灵敏度、安全性、方便性的角度分析，目前为止认为最适宜的半胱氨酸蛋白酶底物释放基团（离去基团）是酰氨甲基香豆素[75]。组织蛋白酶D活性的测定可在酸性缓冲液中使用酸变性的牛血红蛋白作为底物，以添加胃蛋白酶抑制剂（抑肽素）A来抑制组织蛋白酶D作为对照或者先添加终止剂三氯乙酸再加入底物作为对照，通过测定在280nm处的吸光度值来计算酶的活力单位[76]。提取物中的蛋白浓度通过考马斯亮蓝法用牛血清白蛋白作标准进行测定。组织蛋白酶活性在宰后鱼肉贮藏前期活性相对较低，有研究报道：宰后黑鲈白肉中组织蛋白酶D的活性为1.80.21Abs295nm/(ming)，组织蛋白酶H的活性为17039FU/(ming)，组织蛋白酶B的活性为216879FU/(ming)，组织蛋白酶L的活性为9655FU/(ming)[13]。但随着贮藏时间的延长，当鱼肉的pH值下降至一定程度时，组织蛋白酶从溶酶体中释放，其活性逐渐增大，并与钙激活蛋白酶活性呈显著性负相关（P0.05），同时，也与肌原纤维小片化指数呈显著性相关（P0.05）[14]。
4展望
目前，从结构的变化判断，上述四种酶系统没有一种单独的酶系统能全面解释宰后鱼肉在低温贮藏过程中所发生的所有能量代谢和品质变化，推测可能是这些肌肉酶与其他的相关环境因素的共同协同作用。虽然国内外的一些报道指出了钙激活蛋白酶和溶酶体组织蛋白酶等肌肉酶在猪肉、牛肉等哺乳动物宰后肌肉的嫩化方面起到了关键作用，但是对宰后鱼肉的品质影响方面的研究还相对较少，相关的作用机理仍然不太清楚，目前仍存在有关这几种肌肉酶与宰后鱼肉品质相关性的一些争议。关于影响宰后肌肉品质的组织蛋白酶理论以及后期的钙激活蛋白酶理论乃至目前的钙离子单纯诱导降解肌原纤维蛋白的争论在国内外研究得较多，但随着宰后肌肉pH值下降到一定程度，钙激活蛋白酶的活性基本消失，然而低的pH值有利于溶酶体膜的破裂从而释放出组织蛋白酶进入肌原纤维结构中发挥水解酶作用，且其活性一直能被检测得到，因此有必要深入研究钙激活蛋白酶和组织蛋白酶的协同增效作用，比较二者在宰后不同贮藏时期各自的活性变化及其品质相关性分析进而确定在整个贮藏期间内两者的交互作用。另外，国内虽有大量文献报道酶活性的测定方法，但方法却较为单一，并且在提取蛋白酶过程中导致的酶部分活性的丧失也难以反映肌肉中蛋白酶的真实活性，因此，加大对肌肉酶活性测定方法的探究以及保证提取时酶活性的最大程度保留将为宰后鱼肉品质酶学方法的建立提供有力的支撑。对宰后鱼肉在低温贮藏过程中的肌肉酶进行更深入的研究从而形成更完善的理论体系有着广泛的应用前景。内源性蛋白水解酶理论体系的建立将对宰后鱼肉品质评价模型和货架期保藏预测模型的构建、鱼肉宰前的品质分级以及利用基因工程技术进行品种改良等产生重要的意义。
作者：孙蕾经济期刊蕾 黄卉 李来好 杨贤庆 郝淑贤 岑剑伟 杨少玲 赵永强 单位：中国水产科学研究院南海水产研究所 农业部水产品加工重点实验室 国家水产品加工技术研发
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