1材料与方法
1．1材料
清洁级健康雌性Balb/c纯系小鼠100只，6～8周龄，体质量(22±2)g，由徐州医学院实验动物中心提供。HyClone改良型ＲPMI1640培养基及FBS均购自赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司，制备成ＲSV病毒悬液(TCID5010－6．5/mL);鸡卵白蛋白购自美国Sigma公司;Al(OH)3干粉购自上海生物工程有限公司;TＲIzol总ＲNA提取试剂、TIANSscriptcDNA第一链合成试剂盒及2×TaqＲCＲMasterMix购自天根生物科技(北京)有限公司，NGF、LIFmＲNA及GAPDH的引物由上海生物工程有限公司设计及合成;ＲabbitAnti-NGFbeta(免疫组化)购自武汉博士德生物工程有限公司，ＲabbitAnti-LIF(免疫组化)购自北京博奥森生物技术有限公司，浓缩型DAB试剂盒及兔超敏二步法检测试剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。HEＲAcell150i细胞培养箱购自美国赛默飞世尔科技公司，DY-38型稳流稳压定时电泳(PCＲ)仪购自江苏分化分析仪器厂，OlympusBX51显微照相系统购自日本奥林巴斯公司。
1．2造模与干预
将100只小鼠随机分为5组，各20只。哮喘组按文献［7，8］制作哮喘模型，感染组按文献［9，10］制作ＲSV感染模型，合并组及地米组参照上述两组的方法制作哮喘合并ＲSV感染模型，地米组于造模第21～25天腹腔注射地塞米松0．2mg/(kg·d);对照组于第1、14天腹腔注射生理盐水0．2mL，第21～25天给予37℃生理盐水20mL雾化吸入30min。
1．3肺组织病理学检查
饲养第26天，各组以10%水合氯醛3mL/kg腹腔注射麻醉，无菌条件下分离出两侧肺组织。4%甲醛固定液固定右肺中叶和左肺上叶肺组织，制作石蜡切片。行HE染色，400倍光镜下观察肺组织病理改变。
1．4肺组织
NGF、LIF蛋白检测采用免疫组化法。取石蜡切片，按免疫组化试剂盒说明书进行操作，阴性对照用PBS代替。细胞质染成棕色为阳性细胞，用图像分析软件测定NGF、LIF阳性部位，以平均光密度(IOD)值表示其表达量。
1．5肺组织
NGF、LIFmＲNA相对表达检测采用ＲT-PCＲ法。将右肺下叶制作组织匀浆，TＲIzol液提取细胞总ＲNA，检测其纯度及完整性，按说明书逆转录mＲNA为cDNA。NGF上游引物为5'-GT-CAGTGTGTGGGTTGGAGA-3'，下游引物为5'-TTCT-TGTAGCCTTCCTGCTG-3'，片段长度304bp;LIF上游引物为5'-TGCTTGCTGGGTGTATGAAC-3'，下游引物为5'-TTCTGTGGGAGCCTGAACA-3'，片段长度356bp;GAPDH上游引物为5'-CCTTCATTGACCT-CAACTACA-3'，下游引物为5'-CTTCTCCATGGTG-GTGAAGAC-3'，片段长度215bp。反应条件:94℃预变性3min，94℃变性45s，58．8℃(NGF)/57℃(LIF)/60℃(GAPDH)退火45s，72℃延伸2min，共35个循环，最后72℃延伸5min。扩增产物于琼脂糖凝胶上电泳。凝胶成像分析系统测定目的基因与内参基因灰度值的比值，以此表示目的基因相对表达量。1．6统计学方法采用SPSS16．0统计软件。计量资料以x珋±s表示，方差齐时多组间比较用单因素方差分析(One-wayANOVA)检验，方差不齐时多组间比较用DunnettT3检验，组间多重比较采用LSD法。P＜0．05为差异有统计学意义。
2结果
2．1各组肺组织病理学改变
哮喘组支气管、毛细支气管及伴行血管壁周围有大量嗜酸性粒细胞及单核细胞等炎症细胞浸润，支气管黏膜增厚，血管扩张，血管平滑肌增生肥厚;感染组支气管管腔狭窄甚至闭塞，肺泡上皮肿胀，肺泡间隔增宽，间质性水肿;合并组兼具哮喘组、感染组的表现;地米组无明显炎症细胞浸润及间质性改变;对照组肺组织结构清晰，基本无炎症细胞浸润。
2．2各组肺组织NGF、LIFmＲNA及蛋白表达比较。
3讨论
气道神经源性炎症学说认为，气管及支气管上皮可因炎症反应受损脱落，导致感觉神经末梢暴露并释放活性物质;这些递质可反作用于外周靶细胞引起神经营养因子升高［11］。NGF可由外周靶细胞合成，经轴突摄取后逆行转运至背根神经节细胞，具有促进神经细胞生长、存活和分化的作用，能增强神经突触的可塑性，从而刺激神经递质分泌增加［12］;NGF还具有非神经元细胞的生物活性，可参与和整合刺激自适系统的成熟及表达。据文献报道，NGF与LIF同属神经生长因子家族成员，有相似的生物学活性［13］;二者均作为胞外刺激因子作用于效应细胞过程中，具有相同的信号转导通路。当一种因子受到抑制时，另一种因子的表达水平同样受到抑制，故二者共同参与哮喘的发病，在ＲSV感染后导致支气管哮喘发生过程中起协同作用［13］。本研究显示，HE染色后镜下可见，感染组以炎性表现为主，无典型哮喘样病理改变;但合并组病理组织改变较哮喘组、感染组明显加重。据此推测，ＲSV感染后并非直接导致支气管哮喘发生，而是在一定程度上加重哮喘病理组织损伤。另外，与对照组比较，哮喘组、感染组和合并组NGF、LIFmＲNA及蛋白表达均增加，仅与地米组比较无统计学差异。提示哮喘气道神经源性炎症的发生可能与多种神经营养因子共同作用有关，这些因子的作用机制相似，但并非相同［14～16］;地塞米松可同时抑制这些因子表达，引起其他相关致病因子的表达障碍，在临床治疗过程中，寻找艺术论文大纲抑制神经生长因子的抑制剂可减少ＲSV感染后发生哮喘的概率。本研究为哮喘的防治提供了新思路。
作者：王正彪 武怡 张静 单位：徐州医学院 徐州医学院附属医院
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