1HCV感染的免疫学进展
机体感染HCV后，会产生相应的免疫反应，但大部分仍会发展为慢性感染。主要是因为机体缺乏功能完整且及时、持续的免疫反应，所以不足以控制HCV感染［1］。因此，在疫苗研制过程中，必须明确免疫反应在控制HCV感染以及疫苗接种中的作用。在抗HCV感染的免疫反应中，CD4+T细胞和CD8+T细胞均不可或缺，使用抗体清除黑猩猩体内T细胞后，HCV感染时间延长且更易于转变为慢性感染。另外，HLA-Ⅰ类和Ⅱ类等位基因与HCV感染的预后也密切相关。感染HCV后恢复健康的黑猩猩和人体再次接触HCV时，通常能够通过CD4+T细胞和CD8+T细胞反应迅速清除病毒，而且转变为慢性感染的机会较低［2］。HCV感染者对病毒的有效清除不仅需要T细胞具有完整和持续的功能，如分泌γ干扰素(interferonγ，IFN-γ)和白细胞介素12(interleukin12，IL-12)，还需要T细胞具有较强的增殖能力。另一方面，诱导中和抗体一直是衡量传统疫苗效果的重要标准［2－3］。许多成功的疫苗都是通过诱导产生中和抗体发挥作用的。乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)和人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)疫苗接种结果显示，病毒疫苗可以通过诱导机体产生抗体阻止病毒慢性感染［4］。如果机体在急性HCV感染早期出现膜蛋白特异性抗体，则有利于清除病毒。可是，由于HCV的膜蛋白免疫原性较弱，初次感染者往往抗体产生迟缓而且反应较弱［5］。而且，HCV诱导产生的中和抗体的膜蛋白表位经常发生突变，糖基化的膜蛋白与高密度脂蛋白(high-densitylipoprotein，HDL)和B族Ⅰ型清道夫受体(scavengerclassBtypeⅠ，SＲ-B1)的相互作用也会阻断中和抗体与抗原的结合，促进HCV的免疫逃逸。固有免疫也在抗HCV免疫中具有重要作用。宿主在感染HCV后可以迅速产生IFN-λ，参与抗病毒作用［6］，而且IL-28B(IFN-λ3)的单核苷酸多态性与急性HCV感染的恢复和疗效关系密切［7－10］。另外，自然杀伤(naturalkiller，NK)细胞和自然杀伤T(naturalkillerT，NKT)细胞可能参与了控制病毒复制的初始阶段［11］。机体内可能存在记忆性的NK细胞［12］，这为设计以诱导记忆性NK细胞为靶标的HCV疫苗提供了新思路。
2HCV疫苗研制现状和困难
目前处于研究阶段的HCV疫苗主要包括重组蛋白疫苗、合成肽(抗原表位)疫苗、DNA疫苗、病毒载体疫苗和HCV病毒样颗粒疫苗，前四种疫苗已进入临床研究阶段。但是，HCV疫苗有效性的评价标准是机体出现能够阻止慢性感染和疾病发生的免疫反应，而HCV高度的变异性以及宿主对HCV免疫反应能力较弱严重阻碍了HCV疫苗的研制成功。由于ＲNA聚合酶缺乏校正功能，导致HCV病毒具有高度变异性。在HCV的多种抗原中，与研制疫苗关系最密切的中和表位存在于E2蛋白N端的高变区1(hypervariableregion1，HVＲ1)内，它是中和抗体主要的结合位点。HCV经常通过膜蛋白基因突变逃避中和抗体的识别，使机体缺乏针对HCV的有效抗体。由于存在MHC限制性，宿主的遗传因素也会影响机体T细胞对HCV的识别。例如，HCV感染细胞表面的HLA-B57有助于CD8+T细胞对靶细胞的识别并诱导其凋亡［13］，从而促进HCV的自发清除。HCV基因组存在高度保守区，如编码NS3和NS5的区域，这些区域的遗传变异会对HCV的存活造成极大影响。基于这些保守序列，设计针对保守的T细胞表位的疫苗，通过基因工程手段构建候选疫苗，疫苗经过抗原提呈细胞的摄取、处理，以HLA-肽复合物的形式提呈给T细胞，进而诱导T细胞应答，可以缓解HCV高度变异性带来的困扰［14］。但是，设计针对保守的B细胞表位的疫苗则非常困难。HCV经常通过膜蛋白突变逃避宿主的体液免疫反应，这是诱导作用广泛的中和抗体的主要障碍。另外，中和性抗原表位可能是由不连续序列形成的构象表位，这也对设计针对B细胞抗原表位的疫苗提出了挑战。另一方面，宿主和HCV相互作用决定了感染结果，HCV感染可以引起T细胞的功能耗竭。
一旦HCV感染发展到慢性阶段，宿主可能就无法启动有效的免疫反应以清除病毒。合理的疫苗设计策略应是一方面通过设计融合抗原克服HCV遗传多样性带来的困难，另一方面通过加入免疫佐剂以补足HCV膜蛋白免疫原性弱的缺点，进而诱导B细胞产生大量有效的中和抗体，使疫苗在机体刚感染HCV时就可以诱导广泛且高效的免疫反应。HCV感染和疫苗研究的另一个重大障碍是缺乏有效的细胞培养模型和动物模型。目前常用的细胞培养模型包括HCV复制子、可表达病毒糖蛋白的感染性HCV假病毒颗粒(HCVpseudotypeparticles，HCVpp)和在培养上清中产生感染性HCV病毒粒子的细胞培养系统(cell-culturederivedHCV，HCVcc)。首先，HCV复制子系统虽然可以用于研究HCVＲNA的不同编码蛋白的功能以及病毒和宿主之间的相互作用，为新药研发提供良好的研究工具，但是无法用于病毒整个生活史的体外研究。其次，HCVpp包含各种基因型的HCV的结构蛋白，主要用来研究HCV抗体介导的中和作用及模拟病毒进入细胞的全过程［15］。最后，HCVcc系统仅限于2a型HCV(JFH1)及其衍生克隆，而1a型(H77-S)和1b型HCV细胞培养系统新产生的病毒量非常低，从而限制了这个培养系统的应用。另外，Podevin等［16］于2010年发明了无需特殊耗材的原代肝细胞培养方法，培养出的原代肝细胞支持HCV感染的全过程。不仅如此，体外培养系统虽然有助于检测HCV候选疫苗诱导体液免疫反应的能力，但对于检测疫苗诱导细胞免疫反应的能力却没有太大价值。目前公认的用于HCV研究的动物模型只有黑猩猩，但黑猩猩与人类在一些感染免疫相关基因上存在差异［17］，所以黑猩猩与人类在慢性病毒感染，如人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，HIV)、HBV和HCV慢性感染的病理变化、疾病进展和病毒清除方面存在差异［18］。另外，各项研究使用的黑猩猩数量非常有限而且品系相对单纯，这限制了实验结果的意义。另外，将人肝细胞植入小鼠体内形成的嵌合小鼠模型，可以用来研究HCV中和抗体、病毒-受体相互作用和HCV感染的治疗措施，但是这些小鼠均为免疫缺陷型小鼠，它们不能用来研究适应性免疫反应的作用和慢性感染的决定因素［19］。
3HCV疫苗研制进展
为解决HCV高度变异性以及宿主免疫反应能力弱的问题，HCV疫苗的研制策略不断改进，各种类型的HCV疫苗均获得了不同程度的突破。另外，为了增强疫苗的免疫原性，佐剂也开始应用于HCV疫苗的研制。
3．1重组蛋白疫苗
用HCV的重组膜蛋白和核心蛋白作为疫苗靶抗原，诱导机体产生具有交叉反应性的中和性抗体和T细胞应答，是HCV疫苗设计的传统方法。
3．1．1膜蛋白疫苗HBV疫苗通过提纯或重组的HBV表面抗原可以诱导机体产生中和抗体，人们受到启发，使用重组的HCV膜蛋白El/E2蛋白异二聚体生产出的第一代HCV疫苗，注射入7只黑猩猩体内，发现其中5只可以有效抵抗同株HCV的攻击，但需要加强免疫使抗体达到最高滴度时才能发挥作用。另一种以El/E2蛋白异二聚体为免疫原的疫苗，1期临床试验结果显示，受试者体内出现了较强的抗体反应［20］。
3．1．2核心蛋白疫苗HCV的核心蛋白、NS3和NS5是T细胞的主要作用靶点，经常被应用于HCV疫苗设计。诺华公司以酵母菌产生的HCV核心蛋白为靶抗原、以免疫刺激复合物基质(immunostimulatingcomplexmatrix，IMX)为佐剂的HCV疫苗，在30例健康人中进行1期临床试验，其中29例受试者产生了核心蛋白抗体，但仅在2名受试者体内诱导出特异性CD8+T细胞应答［21］。而以加热灭活的表达HCVNS3-核心融合蛋白的酿酒酵母全细胞为免疫原，并加入佐剂IMX设计的候选疫苗GI-5005a，注射入5只黑猩猩体内，发现可以在肝脏和外周血中诱导T细胞应答，但不能清除再次感染的HCV［22］。
3．2合成肽疫苗
合成肽疫苗把T细胞表位组成的肽段注射入体内，通过抗原提呈细胞提呈给T细胞，进而诱导T细胞应答。如果肽序列包含CD8及CD4表位，那么将会诱导比较强的特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocyte，CTL)反应。可是，合成肽疫苗具有人类白细胞抗原(humanleukocyteantigen，HLA)特异性而且只针对T细胞部分表型，而且合成肽免疫原性较弱，虽然已经应用于HCV的治疗，但其诱导的免疫应答强度不能达到理想效果。IC41由5段含有T细胞表位的HCV合成肽组成，使用多聚左旋精氨酸为佐剂。研究发现，接种该疫苗的慢性HCV感染患者体内，虽然T细胞应答强度没有变化，但病毒载量显著下降［23］。
3．3DNA蛋白疫苗
核酸疫苗是继减毒(灭)活疫苗、亚单位疫苗和重组载体活疫苗之后的第3次疫苗革命，一般的核酸疫苗即为DNA疫苗。DNA疫苗的表达序列具有较强的免疫原性，一般采用电穿孔的方式将含有编码抗原基因的真核表达质粒导入机体后，经体细胞摄取、转录、翻译，可表达接近天然构象的抗原［24］。目前，编码HCVNS3/4a和核心-E1/E2的质粒作为HCV的治疗性疫苗显现出了一定的疗效，但是还没有其作为预防性疫苗的研究结果。另外，DNA疫苗的安全性也是值得关注的问题，如外源DNA导入机体细胞后可能整合入宿主细胞基因，进而活化宿主细胞的原癌基因或/和抑制抑癌基因而引起肿瘤形成。
3．4病毒载体疫苗
T细胞在抵抗HCV感染中发挥关键作用，因此人们可以通过腺病毒(adenovirus，Ad)、牛痘病毒、修饰的痘苗病毒安卡拉株(modifiedvacciniaAnkara，MVA)和禽痘病毒等病毒载体生产出HCV的各种结构蛋白和非结构蛋白作为抗原可诱导T细胞应答。其中，由于腺病毒载体可以诱导CD8+T细胞应答和以Th1型细胞反应为主的CD4+T细胞应答，所以被认为是研发HCV疫苗最有前景的载体［25］。把含有HCV非结构蛋白(non-structuralprotein，NS)区和不同血清型Ad载体的疫苗注入恒河猴体内，可以诱导高效且广泛的HCV特异性T细胞应答。以诱导T细胞应答为目标的候选疫苗，以2种不同血清型的腺病毒即黑猩猩源腺病毒3(chimpanzeeadenovirus3，ChAd3)和人源腺病毒Ad6为载体，把HCV的非结构蛋白NS3-NS5B区插入腺病毒载体，这两种载体在人体的血清阳性率都较低，可以诱导T细胞产生IL-1、IFN-γ和肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactorα，TNF-α)，其作用至少可以持续1年［26］。另外，由于MVA具有较强的安全性和免疫原性，并且可以诱导高效且广泛的T细胞反应，因此也被认为是一种具有吸引力的病毒载体［27］。病毒载体MVA与Ad3Ch3的融合载体Ad3Ch3-MVA被用来设计HCV疫苗，约300例静脉毒品注射者参与了这种疫苗的临床试验，以检测疫苗的安全性和有效性，并即将进入2期临床试验［28］。
3．5HCV病毒样颗粒疫苗
通过表达HCV结构蛋白的病毒样颗粒(virus-likeparticles，VLP)诱导机体产生抗体和T细胞应答，是研发HCV疫苗的另外一种策略。由于VLP具有交叉反应性，可以诱导MHC-Ⅰ型和MHC-Ⅱ型免疫反应，因此有助于解决HCV高度遗传多样性所带来的问题，而且VLP的颗粒性质还能刺激树突状细胞成熟，促进抗原加工和提呈，从而增强免疫反应。目前基于VLP部分其他病毒的疫苗已经研制成功［29］，但基于VLP的HCV的疫苗尚未进入临床试验阶段。
3．6佐剂
佐剂是一类能非特异性与抗原结合或混合，可以增强抗原的免疫原性而自身无免疫原性的物质。由于重组的HCV蛋白疫苗和肽疫苗免疫原性较差，所以人们在疫苗中加入佐剂，用来增强疫苗的免疫原性，这显然是疫苗研发的长足进步。佐剂通过与抗原非特异性结合或混合，可以诱导较强的体液免疫反应和CD8+T细胞应答［30］。新型的生物学佐剂通过靶向特定的免疫反应通路，如Toll样受体7(Toll-likereceptor7，TLＲ7)和TLＲ8通路，诱导有效的免疫反应［31］。另外，人们还发现了可以活化特异性免疫细胞的细胞因子佐剂，这些细胞因子在动物身上可以诱导较强的特异性免疫应答［32］。
4小结和展望
虽然不断优化治疗方法可以缓解HCV带来的社会经济负担，但如果不能成功研发有效的疫苗，将无法彻底解决HCV感染所带来的问题。设计HCV疫苗的关键是成功诱导机体产生高效、广泛和持久的免疫反应，进而清除病毒，可目前还没有一种HCV疫苗进入3期临床试验阶段。为尽快研制出理想的疫苗，我们首先需要阐明在HCV的早期感染阶段，病毒和宿主在分子、细胞和免疫水平的相互作用。其次，需要合适的疫苗研发的细胞培养和动物模型。最后，通过多价疫苗、优化载体等技术提高疫苗的可行性。我们坚信通过不断改进HCV疫苗的研发策略，这一世界性难题最终将得以解决。
作者：高见 单位：北京大学
