1、Real-time
RT-PCR检测耐药相关基因MDR1、BCL2L1、LRP、PRKCA的表达取对数生长期细胞，TRIzol试剂提取细胞总RNA，反转录试剂盒合成cDNA，SYBYGreen方法进行实时荧光定量PCR实验。引物设计由Invitrogen公司合成，见表1。PCR反应体系：cDNA1μl，2×SYBRGreenPCRMastermix12μl，引物F/R（上下游引物的终浓度各为15pmol/μl）各0.3μl，DEPC水11.4μl，共25μl。PCR循环设置：50℃2min→95℃10min→（95℃15s→60℃1min）×40个循环（生成扩增曲线）→95℃15s→60℃15s→95℃15s（生成溶解曲线）。SDS2.2软件分析处理数据，管家基因校正目的基因的表达，得到相对定量结果。1.6耐药细胞的保存耐药细胞SKOV3/TAX30分别冻存于含0、10、30nmol/L紫杉醇药物的冻存液里。于冻存后1、3、6月分别复苏细胞，观察复苏情况，MTT法检测IC50。1.7统计学方法对有关数据采用SPSS13.0软件进行独立样本t检验（independentsamplet-test）、单因素方差分析（OnewayANOVA），P<0.05为差异有统计学意义。
2、结果
2.1耐药细胞的建立
SKOV3经300μg/ml大剂量的紫杉醇作用2h后,大部分细胞死亡漂浮，剩余细胞肿胀，伸出树枝状突起呈蜘蛛状，胞质见空泡形成、颗粒增多。少量存活的细胞克隆生长，恢复生长至对数期消化传代，再进行下一次冲击；SKOV3经10~30nmol/L小剂量的紫杉醇作用24h，约50%的细胞死亡，细胞体积增大，形态不规则，胞质内颗粒增多，贴壁性变弱，给药24~72h内最明显，96~120h后逐渐恢复原状。经两种诱导方法获得的耐药细胞系，分别命名为SKOV3/TAX300和SKOV3/TAX30。
2.2耐药细胞的生物特性
2.2.1耐药指数MTT实验结果显示，耐药细胞及其敏感细胞的IC50值及耐药指数，可见小剂量浓度递增诱导的耐药细胞SKOV3/TAX30耐药性较强，见表2。2.2.2平板克隆形成实验在无药物作用时，SKOV3敏感细胞较两种耐药细胞系的克隆形成能力强，见图1A的d组，SKOV3敏感细胞的克隆形成数为（934±16.37），SKOV3/TAX300的克隆形成数为（440±13.75）,SKOV3/TAX30的克隆形成数为（579±9.50）。与敏感细胞SKOV3相比，两种耐药细胞克隆形成数少，差异有统计学意义（P均=0.000），见图1B。而在相同浓度紫杉醇作用下，耐药细胞形成的克隆明显多于敏感细胞。在紫杉醇浓度为5nM时，SKOV3/TAX30可形成（1206±9.50）个克隆，SKOV3/TAX300可形成（870±32.30）个克隆，而SKOV3形成的克隆数仅（202±6.08），差异有统计学意义（P均=0.000）；当紫杉醇浓度进一步升高为50nM和500nM时，SKOV3/TAX30和SKOV3/TAX300形成的克隆数仍明显高于敏感细胞SKOV3。紫杉醇浓度为50nM时，SKOV3细胞与SKOV3/TAX300细胞形成的克隆数相比，差异有统计学意义（P=0.013）,SKOV3细胞与SKOV3/TAX30细胞形成的克隆数相比，差异也有统计学意义（P=0.000）；紫杉醇浓度为500nmol/L时，SKOV3细胞与SKOV3/TAX300和SKOV3/TAX30细胞形成的克隆数相比，差异有统计学意义（P=0.009、0.0001），见图1B。2.2.3生长曲线倍增时间的差异SKOV3敏感细胞和两种耐药细胞系在相同条件下培养7天，细胞增殖产生一定的差异。耐药细胞的生长较敏感细胞减慢，生长曲线的斜率减小，见图2。同时，根据生长曲线计算出SKOV3/TAX300和SKOV3/TAX30细胞的倍增时间分别为28.90h、24.0h，与敏感细胞的倍增时间20.84h相比也有所延长。
2.3耐药相关基因
MDR1、BCL2L1、LRP、PRKCA在各细胞中的表达MDR1、BCL2L1、LRP、PRKCAmRNA在SKOV3、SKOV3/TAX300和SKOV3/TAX30细胞中的相对表达丰度见图3A、3B。两种耐药细胞中，MDR1的表达明显增高，提示SKOV3/TAX300、SKOV3/TAX30对紫杉醇的耐药与MDR1高表达有关。SKOV3/TAX300细胞中PRKCA、LRP的表达均高于SKOV3细胞，差异有统计学意义（P=0.016，P=0.005），BCL2L1的表达与敏感细胞比较，差异无统计学意义（P=0.815）。而SKOV3/TAX30细胞的PRKCA、LRP的表达与敏感细胞比较差异无统计学意义（P=0.154，P=0.206）。BCL2L1的表达低于敏感细胞（P=0.001），见图3B。以上数据表明不同诱导方式导致耐药细胞发生不同生物学变化，可能存在不同的耐药机制。
2.4耐药细胞的保存
耐药细胞SKOV3/TAX30分别冻存在含有0、10、30nM紫杉醇的冻存液中，于冻存后1、3、6月复苏，检测IC50，见表3。1、3月后检测结果提示，在3种药物浓度条件下的细胞IC50没有明显区别，但冻存6月后，无药冻存组的耐药细胞与两种加药冻存组的细胞比较，其IC50明显下降，差异有统计学意义（P<0.01）。同一个药物浓度条件下，无药冻存组的耐药细胞在冻存6月时，出现耐药性下降，而两种加药冻存组细胞在6月的冻存过程中，细胞IC50虽然出现轻度下降，但差异无统计学意义。
3、讨论
3.1耐药细胞的建立
本实验结果提示：增加给药剂量、适当延长无药间歇期，可能延缓细胞的耐药性。由于大剂量冲击诱导与临床治疗模式相似，临床上体内耐药指数≥2倍即足以导致化疗失败[5]，因此大剂量冲击诱导产生的耐药细胞虽然耐药指数较低，也是模拟临床耐药的良好模型。
3.2耐药细胞的特性
本研究的结果表明：在无药物作用时，SKOV3细胞的集落形成能力强于两种耐药细胞SKOV3/TAX300和SKOV3/TAX30，但在不同浓度紫杉醇药物条件下，耐药性最强的SKOV3/TAX30集落形成能力也最强，而敏感细胞SKOV3的集落形成能力最弱，此结果与MTT法检测的耐药性一致。紫杉醇的作用机制是促进微管蛋白二聚体装配成微管，抑制纺锤体形成，将细胞阻断于G2/M期，细胞的有丝分裂异常或停止，使多核细胞的形成增多[6]。诱导的过程中耐药细胞膨胀、形态不规则、细胞体积的增大可能与细胞群体中多核细胞的增多有关。本研究的生长曲线实验中，SKOV3/TAX300和SKOV3/TAX30的倍增时间分别为28.9、24.0h，与敏感细胞SKOV3的倍增时间20.84h相比有明显延长，显示耐紫杉醇的卵巢癌细胞生长速度减慢。细胞周期的阻滞，除导致一些细胞周期特异性药物失效外，肿瘤细胞处于相对静止状态，易对化疗药物产生耐受。
3.3耐药相关基因的检测
卵巢癌紫杉醇耐药机制的研究中，多药耐药（multidrugresistance，MDR）一直是热点。多药耐药是指对一种药物具有耐药性的同时，也对其他结构和作用机制完全不同的化疗药物产生交叉耐受的一种现象。多药耐药的产生是一个多因素的过程，主要包括：（1）细胞内有效药物浓度的降低；（2）细胞内药物活性的改变；（3）凋亡的抑制；（4）肿瘤细胞微环境改变化疗敏感度。P-gp是多药耐药基因MDR1编码的相对分子质量为17kD的一种跨膜糖蛋白，其功能是使细胞内药物浓度降低，药物的作用减弱或丧失，细胞由此获得耐药性。与大多数其他化疗药物的多药耐药机制相似，紫杉醇作为P-gp的作用底物之一，其耐药机制与MDR1基因扩增导致的P-gP高表达密切相关[7-8]。肺耐药相关蛋白LRP是在多药耐药的肺癌细胞株中发现的与MDR相关的非糖蛋白，相对分子质量为110kD，能阻止药物通过核孔进入细胞核，避免其作用于核内靶点，药物运送到胞质的囊泡中，再通过胞吐作用将药物排出体外，从而发生紫杉类药物耐药[9-10]。凋亡抑制基因也参于紫杉醇耐药。BCL2L1基因，全称为BCL-2样1基因（BCL-2-like1）,编码蛋白属于BCL-2蛋白家族，BCL-2蛋白家族通过抑制肿瘤细胞凋亡，导致耐药性[11-12]。PRKCA基因为蛋白激酶Cα（proteinkinaseCalpha），也被称为PKCA、PRKACA、KPCA、AAG6。细胞过度增殖和抗细胞凋亡机制障碍都可导致肿瘤进展和耐药现象发生[13]。另外PKC的作用是使底物蛋白磷酸化而活化，p-gp是PKC的作用底物，当其表达增加或活性增强时，可使大量的P-gp磷酸化而活化，从而产生耐药性。本研究结果提示。SKOV3/TAX300细胞PRKCA、LRP的表达均略高于敏感细胞。但SKOV3/TAX30细胞的PRKCA、LRP的表达与敏感细胞比较差异无统计学意义。BCL2L1在SKOV3/TAX30细胞的表达低于敏感细胞，但SKOV3/TAX300细胞中BCL2L1的表达略高于敏感细胞，结果提示不同方式诱导的耐药细胞，可能存在不同的耐药机制。
3.4耐药细胞的保存
研究表明耐药表型在无药培养液中具有不稳定性[14-15]，而且随着时间的推移，耐药水平也逐渐下降，有的甚至恢复到亲代细胞的敏感度。智星等[16]对耐阿霉素的人肝癌细胞采用持续加药培养的方法保种传代，可提供研究所用的具有相对稳定性的耐药细胞株。本实验在实验初期同样遇到了复苏长期保存的耐药细胞，发现其耐药特性丢失的问题，为了摸索化疗耐药细胞长期保存的条件，我们改变细胞冻存条件，将耐药细胞SKOV3/TAX30冻存在含一定药物浓度的冻存液中，冻存液中药物浓度根据细胞诱导时的药物浓度确定为10和30nmol/L。实验结果提示，耐药细胞冻存在含一定浓度化疗药物的条件下，较无药冻存更能保存耐药的稳定性，从而有利于提供稳定的体外模型。
作者：樊蓓 李红霞 吴玉梅 赵群 邓小虹
