心脑血管的相关缺血性疾病如今已成为临床上一类严重危害健康,降低患者生活质量,致死、致残率高的疾病,主要包括心肌梗塞、脑卒中、肢体性周围血管疾病等.它们共同的发生机理是病理或外力损伤导致动脉或静脉的血流急剧降低或中断阻塞,远端动脉血运和氧供差,使相应的组织或器官出现严重的持久性缺血缺氧损伤,导致组织或器官的功能丧失、发生坏死甚至危及生命[1,2].骨髓干细胞(bonemarrow-derivedstemcells,BMSCs)具有多向分化潜能及可塑性,干细胞技术在治疗心脑血管缺血损伤疾病方面已表现出传统治疗方法无可比拟的优越性,在动物模型研究及临床前试验中取得了大量振奋人心的成果,通过自体BMSCs治疗缺血性疾病,能有效改善缺血组织的功能[3~6].然而,如何更安全、经济、有效地募集治疗所需数量的干细胞成为再生医学领域的技术关键.科学家发现,通过特定细胞因子和药物的刺激并引发一系列细胞信号通路转导,使大量干/祖细胞脱离其骨髓微环境,迁移进入循环外周血的现象,此过程也称为“干细胞动员”(stemcellsmobilization)[7,8].目前研究发现,利用干细胞动员剂可以大量动员BMSCs至缺血损伤组织诱使血管新生,从而改善缺血组织的血流灌注和供氧,修复损伤组织,提升患者的生存质量,降低死亡率[9~11].这是基于“治疗性血管生成”(therapeuticangiogenesis)的理论研究与应用,通过应用细胞因子或干细胞,诱使缺血组织内血管新生,从而改善循环的方法,为心脑血管缺血损伤疾病的再血管化治疗提供了新策略[12~14].干细胞动员具有操作简便、安全有效、微创伤,且可避免干细胞移植引起的免疫排斥反应,应用BMSCs动员的方法和干预策略具有较好的发展潜力.但在促进缺血组织内血管新生的过程中,需要考虑许多因素,如干细胞动员剂的选择、应用的途径、最适宜的剂量和浓度等,本文就BMSCs动员治疗心、脑、血管缺血损伤性疾病的研究现状作一综述,希望对当前的研究和临床治疗提供参考和帮助.
1治疗性血管生成的理论基础
“治疗性血管生成”作为一种新的治疗手段,其目标就是通过诱发其中的一种或多种过程,产生新生血管,参与微循环的形成、血管旁路发生和血管新生,从而恢复血流和氧代谢.随着近年来对缺血组织的血管新生(angiogenesis)研究的不断深入,人们发现机体内血管的新生主要有3种形式,分别是血管发生(vasculogenesis)、血管生成(angiogenesis)和动脉形成(arteriogenesis),其微观的生理过程和发生的机制不尽相同:“vasculogenesis”是指EPCs增殖分化为血管内皮细胞包绕形成新血管的过程;“angiogenesis”主要是在已存在的毛细血管上出芽并延伸,扩展原有的毛细血管网,常见于缺血组织、新生肉芽和肿瘤等部位;“arteriogenesis”是新侧枝动脉的形成,在缓解组织缺血方面具有重大意义,常与血管粥样硬化伴随出现,但其发生的具体机制尚不清楚[12,15].
2骨髓干细胞动员概述
2.1骨髓干细胞生物学特性
BMSCs是由多种干/祖细胞构成的一群异质性细胞,主要包括造血干/祖细胞(hematopoieticstem/progenitorcells,HSPCs)、骨髓间充质干细胞(mesen-chymalstemcells,MSCs)、内皮祖细胞(endothelialprogenitorcells,EPCs),EPCs曾一度被认为仅出现在胚胎发育过程中,直至Asahara等人[16]在成人外周血中分离并鉴定出EPCs,才证实成体内仍存在EPCs,并可参与血管再生过程.最新研究还分离并鉴定出一类极小胚胎样干细胞(verysmallembryonic-likestemcells,VSELs)[6],此外骨髓中可能还存在多种未明确分类的干/祖细胞.在正常生理稳态下,BMSCs大多处于静息状态,栖息在由骨髓基质细胞、成骨细胞、破骨细胞及由胶原、层黏连蛋白、纤黏连蛋白等细胞外基质蛋白的微环境中,这种微环境称为“龛”,多种细胞、细胞外基质及各种因子组成“龛”,并能调节干细胞的丰度和命运.大量研究发现,BMSCs具有多向分化的潜能,在特定的诱导微环境中可横向分化为其他类型的细胞和组织,利用BMSCs对缺血损伤组织进行结构重建和功能修复已经成为干细胞与再生医学领域的研究重点.造血干细胞(hematopoieticstemcells,HSCs)具有自我更新、向造血各谱系分化的能力.此外,HSCs还具有“可塑性”和“横向分化”潜能,可被诱导分化为脑神经细胞、心肌及血管内皮细胞等其他组织细胞[4,17,18].MSCs具有良好的适用性,可用于进行细胞移植,因为他们拥有自我更新和多向分化潜能.通过微环境或化学物质刺激,MSCs可以向成骨细胞、成脂细胞、软骨细胞三系分化能力,还具有向肝细胞、神经细胞、心肌细胞等多种类型细胞分化的潜能[19~21].MSCs分化的平滑肌细胞可作为血管损伤后新内膜形成过程中血管平滑肌细胞增殖的来源,已被证明能有效地改善心肌梗死[22].EPCs是一类能增殖、迁移并特异分化为成熟血管内皮的前体细胞.生理状态下,EPCs主要存在于骨髓微环境,外周血中EPCs的数量仅占单个核细胞的0.01%.很多研究表明,EPCs能从骨髓募集至循环外周血系统,并能归巢至缺血部位,并刺激邻近的内皮细胞增殖、分化,参与新血管的形成[16,23].
2.2骨髓干细胞动员
组织缺血、缺氧损伤发生后会出现相应的炎症反应及病理变化,炎性因子表达多种趋化因子如白介素(IL-2(interleukin2),IL-8等)、肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor,TNF)等炎性因子,间质细胞和炎症细胞旁分泌VEGF(vascularendothelialgrowthfactor),FGF-2(fibroblastgrowthfactor2)等促血管生长因子,同时血管内皮细胞多种黏附分子表达上调,造成缺血损伤微环境对BMSCs动员产生影响[8,11,24].临床观察发现,急性心梗的入院患者在梗死发生数小时后,外周血中CD34+的HPCs和EPCs细胞的数量开始增高,机体在急性损伤后发生本能性的应激反应[25].另外,脑缺血后由于血脑屏障通透性的改变形成细胞因子相对浓度梯度,诱导BMSCs产生定向迁移,而这一系列体内微环境改变也可能是干细胞归巢的始动因素[26].但这种代偿性的动员过程产生干细胞数量较少,利用干细胞动员药物则能大量动员自体BMSCs迁移至缺血损伤部位,因为干细胞归巢于新的组织后,在局部组织微环境的作用下定向分化为相应组织的成熟细胞才能实现组织的再生与功能修复,增强缺血组织的血管新生,从而恢复缺血组织的血运和氧供,一定条件下分化为神经细胞、平滑肌细胞、心肌细胞等,达到缺血损伤组织再生的效果[27](图1).(ⅰ)细胞因子.研究发现了多种细胞因子调节BMSCs募集进入外周血[28],如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)[29]、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)、血管内皮生长因子(VEGF)[30]、血管生成素1(angio-poietin1,Ang-1)、胎盘生长因子(placentalgrowthfactor,PLGF)[31]与雌激素(estradiol)[32]等对骨髓中HSPCs,MSCs,EPCs等干/祖细胞都有一定的动员作用,它们参与损伤血管再血管化,以及缺血损伤组织的修复.(ⅱ)小分子化合物.前期研究证明,一些小分子肽类特异拮抗剂VLA-4抗体,rHDL,S1P,CTCE-0021[33~35];CXCR-4的拮抗剂AMD3100(Plerixafor;Mozobil),T140,T134;以及VLA4的拮抗剂BIO5192[36]能大量提高外周血中HSCs与EPCs的数量.此外,本课题组[9,10,37]前期的研究工作发现,化学小分子化合物三(2-二甲氨基乙基)胺(Me6TREN)能大量动员骨髓中HSCs进入外周血,对临床上疾病的治疗具有潜在的应用价值.(ⅲ)药物.他汀类药物或降脂、抗糖尿病药物等均可引起BMSCs的动员;噻唑烷二酮类药物主要是过氧化物酶增殖物激活受体(PPARs)的激动剂,能增强造血祖细胞HPCs及EPCs在外周血中的迁移能力[38].中药类如银杏叶提取物、葛根素、丹参素能显著提高外周血中EPCs数量,并且明显改善了外周血EPCs的黏附能力、迁移能力、增殖能力和体外血管生成能力[39,40].(ⅳ)体能锻炼.一定强度的体力训练可以增加机体外周血中的EPCs数量[41].
3骨髓干细胞动员在心脑血管缺血损伤疾病中的研究进展
3.1在心肌缺血损伤中的应用
心肌缺血损伤疾病主要是心肌梗死,常规治疗包括药物治疗、介入和外科手术等治疗,这些治疗能够改善心肌缺血和心力衰竭的症状,使闭塞的血管再通,防止梗死扩大,缩小心肌缺血范围,但不能从根本上重塑心肌.通过动员自身的BMSCs进行损伤心肌的修复可能会成为治疗心梗的新策略.鉴于心肌急性炎症反应分泌的细胞因子对表达趋化因子受体(CXCR-1和CXCR-2)的MSCs具有反应性,生长因子类如VEGF动员骨髓中EPCs,甲状旁腺素(parathyroidhormone)动员骨髓中表达CXCR-4的干/祖细胞募集至缺血性心肌,增加新生血管,促进其对梗死部位的血流、血氧、氧代谢及心肌细胞的修复与再生[43].Jujo等人[44]报道了单次注射AMD3100能明显提高模型小鼠心梗后的存活率至60%左右,增加外周血中EPCs的数量,第28天发现梗死区域有新生血管的形成,并减少瘢痕组织,以及改善左心室射血功能.在大量动物实验做出阳性结果的同时,近期有课题组还进行了小规模的临床试验.Achilli等人[45]对ST段抬高型心肌梗塞患者发生后的2~12h内进行G-CSF的干预治疗,并进行了为期3年的观察时间,发现G-CSF组与安慰剂组的梗死面积没有差别,但G-CSF组的舒张压明显要低于安慰剂组.Glover课题组[46]还开展了G-CSF动员干细胞治疗前壁心肌梗塞的随机比对临床试验,也未观察到显著改善的结果.因此,如何合理选择入组病人、设计和优化干细胞动员剂的类型及组合等方案还需进一步研究.
3.2在缺血性脑损伤中的应用
脑卒中是脑缺血损伤疾病中威胁人类健康最严重的一类,具有发病率高、致残率高和死亡率高等特点.目前临床治疗脑卒中的手段主要有溶栓、抗凝及应用神经保护剂等,不能从根本上切实修复受损脑组织.通过大量动物实验与临床研究发现脑缺血发生后,神经系统会释放某些信号因子,如儿茶酚胺类因子进入外周血或通过骨髓中激活的淋巴细胞以旁分泌的方式刺激BMSCs动员至缺血部位进行修复,同时这种神经性的反馈调节可双向刺激骨髓中BMSCs的归巢和动员,人脑急性中风后会向外周血中大量涌入未成熟的表达CD34+的HSCs与EPCs,作为机体启动的防御性代偿修复系统[47].临床试验发现,通过给脊髓损伤病人结合移植MSCs能明显改善神经功能恢复的效果[48].Shyu等人[49]研究发现,注射G-CSF持续动员的HSCs能有效地保护神经细胞,提高脑缺血周围的血管化及神经的可塑性作用,减少梗死的面积,提高生存率.G-CSF动员的MSCs能通过持续分泌胶质细胞源性的神经营养因子、脑源性的神经生长因子及转化生长因子等,激活自身修复机制,对缺血后的脑神经功能恢复起促进作用[50],病理检测发现脑梗死组织周边nestin表达明显增多,神经细胞的内源性修复加强,梗塞病灶周围细胞的凋亡也受明显抑制[51,52].Li等人[53]应用腺病毒基因修饰高表达SDF-1因子,对脑缺血小鼠采用立体定向注射,结果发现神经及内皮祖细胞的CXCR-4表达上调,促进了神经再生与血管新生,且无炎症反应.Wang等人[54]最新报道的SDF-1/CXCR-7信号通路对骨髓源性MSCs动员修复短暂性脑缺血损伤,并且发现CXCR-7动员MSCs的效果强于研究较多的CXCR-4.
3.3在肢体周围血管疾病中的应用
肢体周围血管疾病是各种原因引起的肢体动脉狭窄或闭塞,均可导致病变动脉远端组织缺血、缺氧,组织细胞变性、坏死等.目前临床上常见的有下肢动脉硬化闭塞症、血栓闭塞性脉管炎、肢体缺血型的多发性大动脉炎、糖尿病周围动脉硬化症等.BMSCs可向血管内皮细胞分化,对缺血组织的血管新生具有重要的作用,通过动员患者BMSCs进入外周血,趋化迁移至肢体缺血损伤组织,进一步分化形成新的毛细血管,促其血管的新生,改善和恢复下肢血流,可使部分患者避免截肢或降低截肢风险,改善生活质量[55].Aburakawa等人[56]报道了肌肉多点注射骨髓来源的EPCs能诱导缺血部位新生血管的形成,明显增加缺血下肢的血流灌注量,同时还能刺激招募血管周细胞、骨髓源性的EPCs分化为血管平滑肌细胞,从而促进损伤修复.Fricker[57]发现干细胞动员药物AMD3100动员的自体HSCs也具有一定的修复作用,改善患肢的血供,降低致残率,提高患者的生存质量,还能避免异体移植带来的免疫排斥反应,经动员刺激的骨髓内存在大量原始的BMSCs参与修复,这些细胞的分化能力更强,更利于细胞的融合和血管的新生.Chen等人[10]发现Me6TREN无论是在单次还是连续给药的情况下,均能大量动员表达Flk-1+Sca-1+的EPCs进入外周血;体内实验证实Me6TREN动员的EPCs能募集至缺血组织,促进血管新生,血流灌输恢复至正常值的88%左右,促使下肢缺血模型小鼠血管新生及受损肌肉组织的恢复和再生,并且其治疗效果优于AMD3100.由于骨髓中EPCs表达整合素4阳性,Qin等人[58]的实验利用整合素α4抗体能大量动员骨髓源性的EPCs,显著增强缺血心肌和下肢的血管新生.此外,Teraa等人[59]临床研究发现炎症反应因子IL-6能刺激骨髓中EPCs大量募集至外周血,促进急性下肢缺血患者的血管与组织损伤修复.VEGF和bFGF等因子协同了EPCs的迁移及缺血组织周围的内皮细胞生成血管的作用,利用VEGF因子刺激可大量动员BMSCs迁移至缺血肢体部位,促进血管的形成及血流的灌注[60].MSCs在体外特定的诱导条件下,能分化为血管内皮细胞,在体内还能以旁分泌的方式刺激内皮细胞增殖,促进缺血梗死组织周围毛细血管的新生.目前,Yang等人[61]还开展了Ⅰ期临床试验研究,结果证明应用MSCs移植治疗糖尿病和其他血管闭塞性肢体周围血管疾病是安全无副作用的.
4骨髓干细胞动员的作用机理
已知基质细胞衍生生长因子SDF-1及其受体CXCR-4(SDF-1/CXCR-4信号轴)在HSPCs,EPCs的迁移与归巢过程中发挥重要作用[44].骨髓血管内皮高水平表达SDF-1,参与血管细胞黏附分子-1(vascularcelladhesionmolecule-1,VCAM-1)的黏附作用.SDF-1能加强VCAM-1本身的黏附作用及募集CD34+的干/祖细胞跨内皮的迁移能力.在选择素(selectins)缺乏的情况下,SDF-1仍能促进VCAM-1与其配体VAL-4的黏附[62,63].SDF-1在CD34+细胞的跨内皮迁移和与骨髓基质募集中起关键作用.缺血损伤组织的SDF-1分泌会显著增强,形成SDF-1浓度梯度差,高表达CXCR-4的BMSCs能够沿着SDF-1的浓度梯度迁移至受损部位[63].此外,VAL-4也是干细胞动员中关键因子,抗VAL-4抗体主要通过c-kit受体信号通路诱导干/祖细胞动员,通过裂解骨髓基质细胞表面的VCAM-1而使之不能与其受体VAL-4结合,导致BMSCs挣脱骨髓基质细胞的束缚动员进入血液循环中,归巢至缺血损伤组织[63].G-CSF动员BMSCs时,弹性蛋白酶降解骨髓SDF-1而循环血中SDF-1不受影响,因此骨髓与外周血中SDF-1浓度梯度明显降低,同时,SDF-1的降低刺激骨髓细胞CXCR-4的表达,以及对其配体的敏感性,最终使BMSCs从骨髓动员至外周血.动员的干/祖细胞表面整合素(integrins)家族VAL-4和细胞因子受体c-kit表达降低,而金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs)如MMP-2和MMP-9、以及弹性蛋白酶和组织蛋白酶G的表达水平增加,后者具有降解细胞外基质的作用,通过裂解N-末端氨基酸使SDF-1丧失趋化活性[64].综上,干细胞动员的过程与机制非常复杂,由动员剂引起BMSCs和他们的的骨髓微环境之间的相互黏附作用干扰、胞外基质蛋白的水解诱导、趋化因子与受体相互作用释放进入外周血.BMSCs被成纤维细胞、脂肪细胞、巨噬细胞和内皮细胞及其他祖细胞包围着,具有细致巧妙的细胞-细胞间和细胞-基质间通过黏附分子、整合素系统的作用.去除或扰动BMSCs与骨髓微环境之间的黏附作用是动员发生的必要条件,SDF-1/CXCR-4信号轴、整合素和选择素在动员过程发挥了重要作用[64].此外,干细胞动员过程还会涉及其他因素包括趋化因子、细胞因子及蛋白水解酶.
5小结与展望
干细胞动员作为治疗心脑血管缺血损伤疾病的潜在治疗策略,具有操作简易,安全有效等优势,已经在大量临床前实验研究及小规模的临床研究中取得振奋人心的成绩.然而,对于当前研究发现的干细胞动员剂类型仍存在以下3个问题:(1)细胞因子类仍存在理论上潜在副作用,如其促进血管形成的生物学作用可能加速病人潜在癌症病灶的生长或加速糖尿病病人的视力恶化等风险[65,66];(2)临床上常用的动员剂为G-CSF和AMD3100(正进入临床Ⅲ期试验)主要用于动员HSCs,AMD3100合成工艺复杂成本昂贵,为患者带来沉重的经济负担;G-CSF需要重复给药,给药时间长,有报道提示其能引起骨质疏松、免疫反应等副作用[67];(3)动物实验的阳性结果在小规模的临床试验中尚需结果重复,干细胞动员药物治疗缺血性疾病的长期效果性及安全性尚待深入的临床评估.为了更好地推动干细胞动员技术的临床应用前景,针对当前问题提出以下5点展望:(1)针对性动员骨髓中相应的干/祖细胞的分化潜能来治疗对应的病症,优化和筛选更为安全、高效、经济的干细胞动员剂;(2)进一步阐明干细胞动员的发生过程,完善和明确动员与归巢过程中的信号分子调控机制,为干细胞动员剂的临床应用提供理论基础;(3)完善心、脑、血管缺血损伤性疾病的生理与病理机制,建立完善的动物模型技术平台,评价动员剂治疗的长期有效性与安全性;(4)临床试验研究还需探讨合理的动员方案及入组疾病与人员方案,采用单用1种还是合用2种甚至多种动员剂,及动员剂的合适剂量与应用时间等问题;(5)探索干细胞动员技术在临床应用的可能性建筑期刊,通过大临床试验确证其有效性及安全性,促使干细胞动员技术成为心、脑、血管等缺血损伤性疾病的新策略,进一步实现降低疾病致死率、改善患者预后的目标.
作者：陈海旭 杨超 徐文焕 张晓梅 曾强
