1小鼠攻毒实验
首先将ZJ1208野毒株和ZJ1208-ΔWza缺失株分别接种在5mLTSB中，37℃200r/min摇床培养12h，再转接种于30mLTSB中，同法培养11h，测量菌液OD600，调整ZJ1208野毒株和ZJ1208-ΔWza缺失株菌液浓度OD600为1，用于攻毒小鼠，并涂板计数。将6周龄Balb/c每7只分为一组，共8组。分别将ZJ1208野毒株和ZJ1208-ΔWza缺失株菌液0.3、0.5、1.0和1.5mL／只腹腔接种于各组小鼠。攻毒后每隔2小时观察和统计小鼠发病和死亡情况。
2结果与分析
2.1同源重组pUC18-LR-Kan的构建
用上下游同源臂引物分别从HPsZJ1208野毒株的基因组DNA中扩增得到了Wza基因上游同源臂Wza-UP和下游同源臂Wza-Down(图3泳道1和3)，上游同源臂5'端和下游同源臂3'端端含有USS识别序列，用Kan引物从pET-28质粒扩增得到了Kan基因片段(图3泳道2)；再将3个PCR扩增片以重叠PCR融合成Wza-UP+Kan+Wza-Down外源打靶片段(图3泳道4)。将Wza-UP+Kan+Wza-Down片段克隆入pUC-18质粒构成同源重组质粒pUC18-LR-Kan。经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后验证，得到预期的2684bp同源重组片段和2635bp的线性化质粒pUC18(图4)，外源打靶基因的三个片段测序结果证明没有发生碱基突变。
2.2自然转化法转化
HPs分别用2μg同源重组质粒自然转化HPs的5个不同菌株的感受态菌，经37℃温箱约36~48h培养，其中5个菌株中,ZJ1017、ZJ1208、ZJ1404和ZJ1307菌株在30μg/mLKan-TSA平板上长出菌落(表2)，以组合PCR鉴定(即用Kan引物、Wza引物、同源臂上下游引物Wza-U-F-EcoRⅠ-USS/Wza-D-R-HindⅢ-USS同时鉴定)结果只有ZJ1208的菌落有被鉴定为阳性的(表2,图5A)。将ZJ1208阳性转化子传至第20代提取基因组DNA，再次进行组合PCR验证，结果依然为阳性(图5B)，测序上下游片段和Kan片段正确，以上验证结果表明获得了Wza缺失株，命名为ZJ1208-ΔWza株。
2.3ZJ1208-ΔWza株与野毒株的生物学特性比较
2.3.1菌落形态的比较
将-70℃冻存的ZJ1208-ΔWza缺失株株和ZJ1208野毒株分别涂布在TSA平板上，37℃温箱培养24h后，可见二者均长出半透明，圆润的小菌落(直径约0.5~2mm)；此结果表明与野毒株相比,ZJ1208-ΔWza缺失株的菌落形态并没有发生明显变化(图6)。
2.3.2生长速率的比较
结果如图7所示，在整个生长过程中，ZJ1208野毒株生长速率要快于ZJ1208-ΔWza缺失株，二者都在12h时OD600值达到最大，分别为2.196和1.246；但其差值达到了0.95；ZJ1208野毒株的对数生长期在约10h时结束，而缺失株ZJ1208-ΔWza在培养8h，即提前2个小时结束。二者的活菌数基本都在8~10h间达到最大，但二者每毫升活菌数对数值的差值也在0.4~0.5个数量级之间。在其继续培养之后，二者活菌数均逐渐减少。
2.3.3荚膜染色和形态结构的比较
取对数生长中前期的突变株ZJ1208-ΔWza缺失株株和ZJ1208野毒株进行荚膜染色，显微镜下观察发现，突变株ZJ1208-ΔWza缺失株中存在比例较多的长链状菌体和长杆状菌体，约占总菌数的30%~40%，而ZJ1208野毒株菌体大部分则较短小，松散，单个菌体居多。在荚膜表达量初步比较中发现，ZJ1208-ΔWza缺失株和野毒株菌体周围都可见被染成绿色的荚膜成分存在(图8)。
2.3.4菌体沉降速率比较
将ZJ1208-ΔWza缺失株和ZJ1208野毒株过夜培养的菌液室温静置5h，每隔1h进行观察，2小时后ZJ1208-ΔWza缺失株菌体即可出现肉眼可辨的菌体沉淀，并且随着时间的延长，沉淀越明显；而ZJ1208野毒株菌体在5h未发生沉淀，菌液依然浑浊；此现象与2者OD600变化相符合(图9)。
2.3.5细胞吞噬实验
细菌计数结果表明，1个MOI感染时，ZJ1208野毒株被吞噬的细菌数量为9.25×103，而ZJ1208-ΔWza缺失株为6.95×105，吞噬率分别为0.064%和3.8%；10个MOI感染时，ZJ1208野毒株被吞噬的数量为1.23×105，而ZJ1208-ΔWza缺失株为0.88×106，吞噬率分别为0.085%和0.48%(图10)。说明ZJ1208-ΔWza缺失株比ZJ1208野毒株更容易被PAM所吞噬。
2.3.6小鼠攻毒实验
实验结果表明，ZJ1208野毒株接种的四个组别小鼠都全部死亡，并且随着攻毒剂量的增加，小鼠起始死亡时间随之提前。而ZJ1208-ΔWza缺失株0.3mL接种组未有小鼠死亡，0.5mL组只有一只小鼠死亡，并且死亡时间比同剂量ZJ1208野毒株组的小鼠死亡时间滞后10个小时。ZJ1208-ΔWza缺失株1mL和1.5mL接种组虽然小鼠也全部死亡，但是死亡时间比相同剂量的野毒株ZJ1208组的滞后(表3)。说明将Wza基因缺失后，ZJ1208-ΔWza缺失株对小鼠的毒力相比野毒株ZJ1208有明显下降。
3讨论
构建缺失株在研究微生物生物学特性方面起着举足轻重的作用，但是其转化技术到目前为止还依然不是很成熟;包括多数细菌和真菌在内，其转化方法都具有菌株特异性或其方法本身的不成熟(Juetal.,2012；孙磊等,2005;Xueetal.,1999)；然而HPs更是如此，这也是针对HPs研究中，国内外目前都在努力克服的一个关键性技术难点。Anna(2005)通过自然转化法构建HPs缺失株；Chen(2012)通过构建大肠杆菌-副猪穿梭质粒在电转化副猪嗜血杆菌方面也进行了初步尝试；Zhang等(2012)利用筛选出的天然感受态副猪嗜血杆菌通过自然转化成功获得ompP2缺失株；申果(2013)也通过自然转化成功构建了cdt基因缺失突等。在本实验构建HPsWza基因缺失株的实验过程中，针对筛选的5个HPs菌株，除了对自然转化方法的尝试和优化外，本实验室前后亦对电转化方法进行了摸索和尝试，但最终未能够用电转化方法获得阳性缺失株；采用自然转化法也是仅仅成功构建了ZJ1208HPs菌株，其他4个菌株中3个虽在Kan抗性平板可以长出菌落，但都没能获得阳性缺失株，以上也印证了HPs转化方法的不成熟和HPs菌株缺失株难以被构建的现象。目前推测限制修饰系统可能是副猪嗜血杆菌转化效率低下的一个关键因素。限制修饰系统最初在大肠杆菌中被发现，其分为4种类型(Robertsetal.,2009)，每种类型由一种限制性内切酶和对应的一种甲基化酶组成；不同的菌属或菌株可能又会存在酶结构上的差异性(Tombetal.,1997)。几乎90%的细菌包含限制修饰系统，而且43%的细菌存在以上4种或更多的限制修饰系统(Robertsetal.,2004)；。Ando等(2000)从分子机制水平验证了幽门螺杆菌的限制修饰系统对质粒的转化和重组起着阻碍的作用。因此，在前期电转方法的尝试中，根据Donahue等(2000)的方法，本实验室亦尝试利用无细胞抽提物(cellfreeextracts,CFEs)先预处理质粒，然后再转化副猪，但并没有取得成功。并且质粒在被CFEs处理回收后，有大量质粒被降解，条件的优化并不能抑制质粒的降解；另外，人们也通过预先确定受体菌中的限制修饰系统所包含的甲基化酶的种类，从而用商品化相应的甲基化酶在试管中预先处理，再转化受体菌，从而证明也可以提高外来质粒的转化效率(Kimetal.,2010)。基于以上经验，笔者认为应该先从基因水平上确定副猪嗜血杆菌的限制修饰系统的种类，然后有针对性的利用甲基化酶来修饰重组质粒，无论是针对自杀质粒或是穿梭质粒，或许此方式可提高自然转化和电转化的转化效率。荚膜合成基因在大肠杆菌和其他菌属已被鉴定出，由于其外膜合成基因和蛋白空间构象具有保守性，华中农业大学通过对HPs基因进行测序，并将其与其他菌科的相关基因和蛋白进行序列和空间构象对比，获得了HPs相关的基因序列功能，同时荚膜合成相关基因亦被鉴定出来，其中在HPs中被鉴定出的Wza基因被推测具有荚膜多糖运输功能(Xuetal.,2011)。因此，本实验通过构建HPs的Wza基因缺失株，一方面来研究证实Wza在HPs中的功能，另一方面来研究荚膜在HPs毒力和致病性中的作用。从本次实验结果来看，ZJ1208菌株至少在体外培养时，野毒株和Wza缺失株都可形成较薄的荚膜，并不能在光学显微镜下看到明显差异；或许其原因可能存在除Wza基因外其他有关荚膜合成的代偿代谢途径，另外ZJ1208-ΔWza缺失株在室温静置可形成菌体沉淀，而ZJ1208野毒株不能，并且在静止时其OD600在1~2h稍有增长，随后平稳，说明ZJ1208野毒株在短时间静置时有菌体进行了分裂繁殖，且不形成沉淀。Cheng等(2010)对肺炎杆菌的一种粘液蛋白合成基因rmpA缺失后，菌体K2荚膜合成减少，从而导致菌体粘度降低，低速离心时，rmpA缺失株可以在试管形成沉淀而野毒株不形成沉淀，并且缺失株对小鼠的毒力亦降低；因此作者推测，ZJ1208的Wza基因亦只对HPs荚膜合成中的一种或几种粘性多糖的运输或合成起着关键性作用，但并不在菌体荚膜的所有多糖的运输或合成中起着关键性作用。另一方面，通过对ZJ1208-ΔWza缺失株株和ZJ1208野毒株的菌落形态，荚膜染色菌体形态,生长速率以及抗PAM吞噬能力大小和对小鼠毒力等生物学特性的初步比较和分析后，发现其二者的菌落形态并没有明显的差异，ZJ1208-ΔWza株生长速率相比起ZJ1208野生株表现的明显较慢，作者认为可能是缺失株在菌体荚膜形成过程中的异常从而使其对培养环境相较于野毒株表现的更敏感和脆弱，使其活菌死亡或是裂解的快，亦或是缺失株本身在生物代谢上的异常从而造成了其生长的缓慢；另外，在8-~10h间，活菌数达到最大，这与OD600变化并不一致，原因可能是菌体死亡速率与二分裂的速率基本持平，但ZJ1208-ΔWza株菌体比起ZJ1208野生株菌体裂解的更快，因此可以看到对数生长曲线中ZJ1208野生株在8~10h后仍然在攀升,而ZJ1208-ΔWza株已基本保持平行状态，，这从另一方面也验证了作者对缺失株对培养环境相较于野毒株表现的更敏感和脆弱这一推测；同时，缺失株中较长的菌体比例明显增加，可能原因是其生长缓慢，造成了菌体二分裂的周期延长和缓慢，从而使菌体与菌体之间连接在一起，最终形成了看似较长的菌体；在抗PAM吞噬实验中，相同MOI情况下，PAM对ZJ1208-ΔWza的吞噬能力显著高于ZJ1208野生株，尤其在MOI为1并作用1h的情况下，二者的差异尤为显著；另外，在MOI增加时，野生株ZJ1208被PAM吞噬的数量亦成明显增长，但ZJ1208-ΔWza株被吞噬的数量却增加的幅度较小，甚至不明显；其可能原因是在MOI为1，菌体与PAM相互作用1h的情况下，PAM对ZJ1208-ΔWza菌体的吞噬几乎到达饱和状态，因此在增加菌体数量时，一定数量的PAM亦不能更高效地对其进行吞噬，而野生株ZJ1208菌体相比较ZJ1208-ΔWza，其对PAM不敏感，PAM对野生株ZJ1208吞噬的效率并不高，此时增加菌体数量时，可以较线性的增加PAM对ZJ1208的吞噬数量。小鼠的毒力实验亦表明了ZJ1208-ΔWza和野生株ZJ1208的毒力存在明显的差异，其在0.3和0.5mL组表现得尤为明显。
4结论
本实验在生长速率，菌落形态，菌体形态，荚膜生成情况以及抗PAM吞噬能力和对小鼠毒力等方面对ZJ1208-ΔWza缺失株与野毒株进行了比较，结果表明ZJ1208-ΔWza株生长速率等方面相较野毒株有明显的降低，其OD600差值达到了0.95，相对应其活菌数值也低于野毒株，其菌体形态亦出现了长杆状和长丝状，荚膜分泌情况在光学显微镜下未看到明显差异，抗PAM吞噬实验中，ZJ1208-ΔWza比ZJ1208野毒株表现的更为敏感，并且其对小鼠的毒力亦明显减弱以上结果证明Wza基因的缺失对ZJ1208菌株的生物学特性产生了一定影响，为进一步研究其在HPs致病机理中的作用提供基础资料。
作者：单位：康磊 王一成 袁秀芳 徐丽华 江军 闵智宇 蒋佳颖 安徽农业大学 浙江省农业科学院
