摘要：禽流感是禽流行性感冒的简称，它是由甲型流感病毒的一种亚型（也称禽流感病毒）引起禽发生急性出血性的传染性疾病，以引发呼吸道发病或隐性感染为特点。目前疫苗免疫接种是预防本病的主要措施。在产业化灭活疫苗生产过程中，传统灭活工艺（使用2%的甲醛作为灭活剂）存在着局限性，其中甲醛含量虽未超过国家标准，但多余的游离甲醛醛基不断降解病毒的抗原，致使抗体效价降低、保存期缩短以及动物机体副反应的发生。
关键词：灭活工艺；病毒浓缩；重组禽流感病毒灭活疫苗
1禽流感概述及现行工艺讨论
禽流感病毒依据血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的抗原特性，将禽流感病毒分成15种特异的血凝素亚型病毒和9种特异的神经氨酸酶亚型病毒[2]。不同禽流感亚型病毒毒力差异很大，同一亚型内不同的毒株及同一毒株感染不同宿主时其毒力也不尽相同。非致病性毒株和低致病力毒株感染后，往往只引起感染动物一些轻微的临诊症状；而高致病力毒株即可引起大于70%以上的感染动物死亡率。禽流感病毒感染后可以表现为轻度的呼吸道症状、消化道症状，死亡率较低；或表现为较严重的全身性、出血性、败血性症状，死亡率较高[3]。这种症状上的不同，主要是由禽流感病毒的毒型决定的。
2甲醛在禽流感疫苗灭活中的主要问题
目前，在禽流感疫苗生产中，用甲醛作为灭活剂进行病毒的灭活。甲醛是一种有强烈刺激性的致癌物质。其既可作用于病毒含氨基的核苷酸碱基（如A，G，U）[4-5]，又可作用病毒壳蛋白。作用于病毒壳蛋白时，易使蛋白质发生交联或病毒颗粒聚集，不能再作用于壳蛋白内的核酸。这样，病原体蛋白的抗原性会遭到严重破坏，并可能有病原体存活。故而为了使病原得到充分的灭活，以免发生散毒事故发生，在疫苗生产过程中，均采用加大甲醛浓度及延长灭活时间等措施。这样的结果就可能造成，疫苗产品中残留大量游离甲醛，若随疫苗注入机体后，会产生刺激性反应。且在疫苗的保存过程中，多余的游离甲醛醛基不断作用于病毒的抗原，使抗原在醛基的作用下逐渐降解，这样疫苗中的有效成分不断流逝，不仅缩短了疫苗的保存期，还降低了疫苗免疫动物后抗体水平的产生[6-7]。
3材料与方法
3.1实验材料3.1.1毒株、鸡胚和实验动物1）毒株重组禽流感病毒H5亚型二价（Re-6株+Re-8株）2）非免疫鸡3）SPF鸡3.1.2主要生物制剂及化学制剂硝酸纤维素膜（NC膜）、膜包、白油（进口佐剂）、司苯-80、吐温-80、硬脂酸铝、甲醛溶液。3.1.3主要仪器设备抗原浓缩设备、自动控制全不锈钢乳化罐和灭活罐、纯水系统Milli-QPLUS、漩涡混合仪。3.2实验方法3.2.1重组禽流感病毒灭活疫苗原液的制备选择的重组禽流感病毒H5亚型二价（Re-6株+Re-8株）用灭菌的生理盐水做10-4稀释，接种于发育良好孵化的10～11胚龄健康易感的SPF鸡胚上，每胚0.1mL，置36℃温室内孵育。等待观察，鸡胚接种后，照蛋2次/d，将24h内死胚弃去直至72h后，全部取出置于2～8℃冷却12h。将冷却的鸡胚取出，用碘酊消毒气室部位，然后以无菌手术除去气室部卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜，吸取胚液，完成重组禽流感病毒灭活疫苗原液的制备。３.2.2传统灭活工艺将无菌检验合格的重组禽流感病毒灭活疫苗原液混合于一个灭活罐内，吸取数毫升样品用于毒价检测。其余病毒原液加入甲醛溶液，随加随搅拌，使其充分混合，甲醛溶液的终浓度为2%。３.2.3新的灭活工艺将无菌检验合格的重组禽流感病毒灭活疫苗原液混合于一个灭活罐内，吸取数毫升样品用于毒价检测。将待浓缩的病毒原液用连续离心机12000r/min，至少2次，然后将离心处理的病毒原液用0.45μm滤膜过滤，以去除病毒液中的杂质和杂蛋白。其余病毒原液加入甲醛溶液，随加随搅拌，使其充分混合，甲醛溶液的终浓度为2%。３.2.4重组禽流感病毒灭活疫苗原液中甲醛浓度的检测1)对照品溶液的制备：如被测样品为油乳剂疫苗，取已标定的甲醛溶液适量，配成每1mL含甲醛1.0mg的溶液，精密量取5mL于50mL量瓶中，加20%吐温-80乙醇溶液10mL，加水至刻度，摇匀，既得。2)供试品溶液的制备：油乳剂疫苗用5mL刻度吸管量取本品5mL，置50mL量瓶中，用20%吐温-80乙醇溶液10mL，分次洗涤吸管，洗液并入50mL量瓶中，摇匀，加水稀释至刻度，强烈振摇，静止分层，下层液如不澄清，过滤，弃去初滤液，取澄清续滤液，即得。3)检验法：精密吸取对照品溶液和供试品溶液各0.5mL，分别加醋酸－醋酸铵缓冲液10.0mL，乙酰丙酮试液10.0mL，至60℃恒温水浴15min，冷水冷却5min，放置20min后，照分光光度法，在410nm的波长处测定吸收度，计算即得。3.2.5判定标准表1）甲醛溶液含量（含40%甲醛）应不超0.2%。甲醛溶液称取量（W甲醛溶液）：0.2579g，甲醛溶液含量：37.10%。2）对照品溶液吸收度(A对照品)：0.63L3）吸收度(A供试品)：供试品1为0.22L，供试品2为0.224L。4）计算公式：甲醛溶液（40%）含量%（g/mL）=0.25×A供试品/A1.0mgA1.0mg=A对照品×100/W甲醛溶液×1000×甲醛溶液含量3.2.6重组禽流感病毒灭活疫苗免疫效果的检验主要用检验用材料：24日龄SPF鸡、禽流感病毒H5亚型二价抗原批号201501来源哈兽研、重组禽流感病毒灭活疫苗（H5亚型二价）1）检验方法：用24日龄SPF鸡15只，其中10只鸡每只肌肉注射疫苗0.3mL，5只鸡不接种作为对照。接种后21d，分别采血，分离血清，用禽流感病毒H5亚型二价抗原测定HI抗体。2）判定标准：免疫鸡HI抗体平均滴度（GMP）应≥6log2，对照鸡均应为阴性。
4结果
最后,传统灭活疫苗产品（按《规程》规定生产）保存15个月后，其效价下降明显，已不能达到《规程》的要求，说明传统灭活疫苗产品保存期仅为12个月，新的灭活疫苗产在保存期18个月后，用其免疫鸡只，其效价仍能达到《规程》要求.试验结果说明，相比于传统灭活工艺的灭活疫苗产品，新的灭活工艺的灭活疫苗产品的保存期有显著的延长。
5讨论
新的灭活工艺也是按照SOP标准规程的灭活方法加入0.2%的灭活剂（甲醛）进行灭活，但不同之处是在于在加入灭活剂前制备的病毒液要通过过滤离心设备进行杂质及杂蛋白的去除。这样做的优点是为病毒浓缩做好基础，使浓缩时的病毒液可以纯净无杂质，防止浓缩仪的膜包堵塞影响浓缩效果。此外，在病毒液加入灭活剂后通过美国PALL公司的超滤浓缩设备及配套膜包进行病毒液的浓缩和甲醛的洗脱，这样做的优点是有效地提高疫苗的抗体水平和降低病毒液中的甲醛浓度，新的灭活工艺并不是完全地改变传统灭活，而是在其之上加入了更为优化的机器设备，控制好一切可能会影响灭活过程的环节，提升了疫苗品质的同时也降低了可能造成副反应的几率。
参考文献
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[2]张平,边旭,刘桂林.禽流感病毒分子生物学研究进展[J].畜禽业,2008(06):7-12.
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作者：张婷婷 单位：哈药集团生物疫苗有限公司
