1ANSD转基因小鼠模型的技术及应用
1.1ANSD外源基因过表达小鼠模型
将与疾病相关目的基因插入到小鼠基因序列中构建转基因小鼠模型为研究ANSD的分子机制提供了强有力的工具。目前最常用的构建转基因小鼠的核心技术是显微注射法[23]，即将目的基因注入受精卵的原核，再将受精卵植入假孕小鼠体内，使外源基因与受精卵DNA发生整合，随着小鼠胚胎的生长发育，再以分子生物学方法从新小鼠中筛选出整合有导入基因的小鼠，进一步稳定小鼠品系。例如，2013年Schoen等[26]就利用受精卵原核显微注射法获得了Diap3基因过表达转基因小鼠模型，并对其进行听力学测试，电生理检测，小鼠耳蜗形态学观察，进而揭示Diap3基因过表达所导致的ANSD病理变化和致病机制。
1.2ANSD基因敲除小鼠模型
广义的转基因小鼠类型包括外源DNA的导入和内源DNA的移除[33]。基因敲除技术是一种利用胚胎干细胞(embryonicstemcell，ESC)体外培养和同源重组技术，定向改变细胞或生物个体遗传信息的手段[34]。基因敲除小鼠又分为常规基因敲除和条件性基因敲除小鼠。常规基因敲除是通过基因打靶，把需要敲除的基因的几个重要的外显子或者功能区域直接敲除或破坏。此类基因敲除小鼠一般用于研究某个基因在对小鼠全身生理病理的影响，易产生胚胎致死的后果，较难获得理想的小鼠模型。条件性基因敲除小鼠是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的，Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组的原理，首次实现了ESC的外源基因的定点整合[35]，这一技术称为"基因打靶"(genetargeting)或"基因敲除"(geneknockout)，利用这种ESC的显微注射就可以制作出基因敲除小鼠(knock-outmice,KO)[36]。由于这一工作，Capecchi和Smithies于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。目前常用的重组酶有噬菌体P1的Cre重组酶和啤酒酵母菌的FLP重组酶[37]，他们分别识别loxP序列和FRT序列。在基因打靶过程中，把两个loxP位点放到目的基因一个或几个重要的外显子的两边。该小鼠和表达Cre酶小鼠杂交之前，其目的基因表达完全正常。当和组织特异性表达Cre酶的小鼠进行杂交后，可以在特定的组织或细胞中敲除该基因，而在其他组织或细胞该基因表达正常。基因打靶是目前首选的基因敲除方法。在构建ANSD小鼠模型时，多数研究采取了此类方法（见表1）。如2006年IsabelleRoux等[32]在Cell上发表了OTOF基因敲除小鼠导致ANSD的报道。构建小鼠模型时，他们通过同源重组原理将体外构建的基因敲除载体经体外转染导入ESC中，最终获得OTOF基因功能缺陷的嵌合体动物。嵌合体动物回交后，可从其后代中筛选出存在OTOF缺陷型的纯合子，即获得了OTOF基因敲除小鼠。
1.3ANSD突变基因敲入小鼠模型
基因敲入小鼠(Knock-inmice,KI)是指利用同源重组原理，将外源目的基因插入到核基因组目标基因序列的内部或内源目标基因启动子之后的转基因小鼠。其制备方法类似于KO小鼠，区别在于载体的设计不同，即在一个内源基因编码区被删除的同时，在该位点插入另一个相关基因编码区。常用于：①改变目的基因的功能。如为了验证某个位点的氨基酸对该蛋白的重要性，用另一个氨基酸序列替换原有序列；②改变转录效率：过表达或者低表达靶基因产物；③研究基因表达谱：构建一个荧光报告基因载体，通过其表达的产物以示踪靶基因在组织中的表达谱。2006年，Delmaghani等将携带R183W突变的PJVK基因导入小鼠，成功获得了ANSD动物模型。
2ANSD转基因小鼠模型的表型特点及相应致病机制
ANSD临床表现多样[38]，目前已鉴定和克隆的ANSD相关基因十余种，但该病致病机制和部位未明，导致临床治疗效果各异。本文总结了ANSD转基因小鼠模型的表型特点，由表2可看出除两组研究（NO.4,8）未做完整的ANSD听力学检测外，其余转基因小鼠均表现出ABR未引出或明显异常，OAE正常或基本正常。虽然具有相同的听力表型，但研究者们利用免疫组织化学，分子生物学技术及扫描电子显微镜等方法对耳蜗及蜗后神经进行了形态学观察，阐明了ANSD不同的致病机制（表2）。结合听力学表现和基因型，对ANSD病变部位进行定位分析可得出，病变可位于内毛细胞，螺旋神经节以及内毛细胞突触-听神经的传导通路。下面将以遗传性ANSD相关的三个基因为代表，分述各转基因小鼠模型对ANSD致病机制的探索。
2.1Otof-/-小鼠模型
OTOF基因是第一个克隆的与非综合征型ANSD相关的基因，由Yasunaga等[9]于1999年首先发现并命名。2003年，Kelley研究小组对4个非综合征型隐性遗传性ANSD家系采用连锁分析与突变检测的方法，鉴定出OTOF基因是这4个家系的致病基因，从而确立了第一个与非综合征型ANSD相关的致病基因[39]。2006年，为探索OTOF致病的分子机制，IsabelleRoux所在的实验室成果建立了OTOF基因敲除小鼠模型[32]，发现OTOF基因敲除小鼠呈现极重度聋，Otof-/-小鼠无法引出ABR波，而DPOAE在Otof-/-，Otof+/-，Otof+/+三组小鼠中未见有意义的差别，听力检测符合听神经病表型。尽管带状突触的形态和钙离子电流的正常，但突触囊泡的胞吐作用几乎完全消失。因此，otoferlin对于囊泡的胞吐作用是极为重要的，且作为一种钙离子感应器，在内毛细胞带状突触处触发膜融合。
2.2Dfnb59R183Wknock-in小鼠模型
PJVK基因由Delmaghani等[29]首次发现并命名，又叫DFNB59基因，是除OTOF基因之外的另一个与非综合征型隐性遗传性听神经病相关的致病基因。2006年，Delmaghani等报道了来自伊朗的4个常染色体隐性遗传性听神经病家系，通过分子遗传学研究，首次在1个家系中发现了PJVK基因T54I错义突变，3个家系中检测到该基因的R183W错义突变。于是Delmaghani等[30]利用第一部分介绍的基因敲入技术构建了含有R183W突变点的Knock-in小鼠模型。听力学检查发现在高频ABR形状异常，振幅变小，潜伏期延长，DPOAE正常，符合ANSD听力学表现。研究中使用光学显微镜和扫描电子显微镜在不同年龄阶段对Knock-in小鼠进行观察，发现耳蜗、听神经和脑干均未见结构性异常或脱髓鞘等病理改变，结合小鼠听力学特征推断,PJVK基因突变所致ANSD的病变部位主要位于听觉传导通路的神经元功能异常，而内毛细胞的功能不受影响。
2.3Diap3转基因小鼠模型
DIAPH3基因是第一个发现与常染色体显性遗传性ANSD相关的致病基因。2004年Kim等[40]报道了一个欧洲的常染色体显性遗传性ANSD大家系，首次鉴定AUNA1基因座。2010年，Schoen等[41]对AUNA1家系4代47人行DIAPH3基因测序分析，发现DIAPH3基因5’UTR区高度保守的GC框有c.-172G>A的突变，并经一系列试验证明其为AUNA1家系的致病突变。但是DIAPH3基因的致聋机制却仍不清楚。于是，Schoen研究团队利用转基因技术建立了两系DIAP3过表达的转基因小鼠模型[26]（Diap3是人类DIAPH3在鼠类同源基因）。对小鼠进行ABR及DPOAE听力学测试，使用免疫组化技术及电子显微镜观察小鼠耳蜗螺旋神经节细胞、毛细胞及其静纤毛的变化。研究发现：随着转基因小鼠年龄的增长，耳聋程度逐渐加重。711系在4、8周时仅有12Hz20dB的轻度耳聋，当到16和24周时，小鼠耳聋逐渐由40dB加重至60dB；在924系中：4、8周未见听力损失，当到达16和24周时，小鼠听力阈值（12和24Hz）逐渐由35dB加重至50dB。与此同时，DPOAE均未在两系小鼠中观察到与野生小鼠有统计学意义的差别，这说明虽然听力阈值的下降，但耳蜗外毛细胞并未受累。在电子显微镜的观察下，外毛细胞形态未见异常，内毛细胞的静纤毛随着时间的变化而逐渐变长，相互融合。两系小鼠的内毛细胞变化与听力损失进程具有相关性。但是，两系小鼠24周龄后内毛细胞严重减少，并不与听力损失的发生、进展及静纤毛病变存在比例关系。基于此，Schoen认为DIAPH3基因在内毛细胞的静纤毛的肌动蛋白微丝中有集合和维持作用，并且有可能影响内毛细胞带状突触；两系转基因小鼠的建立极大促进了人们对常显遗传的听神经病发生机制的理解。
3展望
随着人类基因组计划的完成及测序技术的飞速发展，会有越来越多的ANSD致病基因不断被鉴定和克隆，更多的基因功能也有待进一步研究。从动物水平揭示ANSD发病机制，不仅能更好的从整体水平分析相关基因在生理与病理过程中的作用，还可以为临床有效的治疗方法提供线索。相信随着遗传修饰技术的不断进步，小鼠转基因模型的应用前景会愈加广阔，进而高效稳定的服务于ANSD患者。
作者：王莉 王秋菊 单位：解放军总医院 南开大学医学院
