１材料与方法
１．１材料
好ＰＣＲ３１ＳＯＣＳ３真核表达载体和ＰＣＲ３１空载体由德国Ｍａｘｉｍｉｌｉａｎｓ大学ＤｒＡｕｅｒｎｈａｍｍｅｒ惠赠。雄性ＣＤ１小鼠购自北京维通利华公司（合格证编号０１２６３２７）。链脲佐菌素（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ，ＳＴＺ）购自Ｓｉｇｍａ公司。ＴｒａｎｓＩＴＥＥＨｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃＤｅｌｉｖｅｒｙＳｏｌｕｔｉｏｎ购自美国Ｍｉｒｕｓ公司。核蛋白提取试剂盒购自南京凯基公司。兔抗ＳＯＣＳ、αＳＭＡ抗体购自Ａｂｃａｍ公司，兔抗ＣＫ１８抗体购自北京博奥森公司，兔抗ｐＳＴＡＴ３抗体购自ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ公司。
１．２方法
１．２．１动物模型制备及分组
应用雄性ＣＤ１小鼠（体重２０～２５ｇ），随机分为对照组（Ｎ组）、糖尿病组（ＤＭ组）、ＳＯＣＳ３质粒注射组（ＤＭ＋Ｓ３）和空载体注射组（ＤＭ＋Ｖ）。ＤＭ组、ＤＭ＋Ｓ３组和ＤＭ＋Ｖ组小鼠单次腹腔注射ＳＴＺ（１５０ｍｇ／ｋｇ）诱导糖尿病模型。对照组注射相同体积的溶剂对照，ＳＴＺ注射后７２ｈ测定血糖，尿糖试纸测定尿糖，血糖≥１６７ｍｍｏｌ／Ｌ，尿糖（～）定为ＤＭ模型成功。成模后８周ＤＭ＋Ｓ３组小鼠尾静脉快速注射ｐＥＦＦＬＡＧＩ／ｍＳＯＣＳ３质粒（１ｍｇ／ｋｇ），ＤＭ＋Ｖ组用同种剂量和方法注射ｐＥＦＦＬＡＧＩ空质粒，此后每隔７天注射１次。
１．２．２标本收集
于注射ＳＴＺ后成模１２周每组取６只小鼠，处死后切取肾脏，取部分肾皮质经戊二醛固定后用于电镜观察；部分肾皮质经福尔马林固定用于免疫组化染色；部分肾皮质经液氮速冻后保存于－８０℃冰箱，用于Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ和ＲＴＰＣＲ检测。
１．２．３免疫组化
免疫组化染色采用ＳＡＢＣ法，肾组织４μｍ厚连续切片，常规脱蜡至水，经抗原修复、血清封闭后滴加一抗αＳＭＡ和ＣＫ１８（１∶１００稀释），４℃过夜，ＰＢＳ清洗后依次滴加二抗和三抗，以ＰＢＳ代替一抗作为阴性对照，ＤＡＢ显色，光镜观察阳性信号。
１．２．４Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ
肾皮质加入蛋白裂解液，匀质，离心后取上清液测定蛋白浓度。每个样品取５０μｇ蛋白，依次经电泳、转膜、脱脂奶粉３７℃封闭２ｈ、一抗４℃过夜、洗膜、二抗３７℃孵育１５ｈ；洗膜后用ＥＣＬ化学发光法显影。以βａｃｔｉｎ为内参照。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ条带信号强度应用ＬａｂＷｏｒｋ４．５图像分析软件进行定量分析，测定各条带的吸光度值。
１．２．５ＲＴ-ＰＣＲ
Ｔｒｉｚｏｌ法提取细胞总ＲＮＡ，逆转录成ｃＤＮＡ，以ｃＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增。１８ＳｒＲＮＡ５′ＡＣＡＣＧＧＡＣＡＧＧＡＴＴＧＡＣＡＧＡ３′，５′ＧＧＡＣＡＴＣＴＡＡＧＧＧＣＡＴＣＡＣＡＧ３′（２３８ｂｐ），ＣＫ１８的上、下游引物分别为：５′ＣＧＣＴＣＧＴＴＣＡＣＧＡＧＴＧＧＡＣＣＣＧＧＴ３′，５′ＣＣＡＧＣＴＧＣＣＧＡＣＧＧＡＧＧＴＴＧＡＴＧＡ３′（３８８ｂｐ），αＳＭＡ的上、下游引物分别为：５′ＣＴＧＡＡＧＡＧＣＡＴＣＣＧＡＣＡＣ３′，５′ＧＡＣＴＣＣＡＴＣＣＣＡＡＴＧＡＡＡＧ３′（５２０ｂｐ）。ＳＯＣＳ３的上、下游引物分别为：５′ＣＴＧＴＧＴＡＣＴＣＡＡＧＣＴＧＧＴＧＣ３′，５′ＣＴＣＡＧＴＡＣＣＡＧＣＧＧＡＡＴＣＴＴ３′（１８３ｂｐ）。扩增条件：预变性９５℃５ｍｉｎ，进入循环，变性９４℃４５ｓ，退火５５℃６０ｓ，延伸７２℃６０ｓ，３６个循环后７２℃延伸１０ｍｉｎ。将ＰＣＲ产物进行电泳，然后置于凝胶图像分析系统（ＵＶＰ公司，美国）进行吸光度扫描，以１８ＳｒＲＮＡ作为内参照校正，用目的基因的吸光度与１８ＳｒＲＮＡ吸光度的比值代表目的基因的相对表达含量。
１．３统计学方法
所得数据用珋ｘ±ｓ表示，用ＳＰＳＳ１３０软件进行统计学分析，多组定量数据的比较采用方差分析的方法，多组定量数据间的两两比较采用ＳＮＫｑ检验的方法，Ｐ＜００５为差异有统计学意义。
２结果
２．１形态学变化
糖尿病小鼠肾小管上皮细胞出现空泡变性，部分线粒体发生髓样化或致密化。
２．２糖尿病小鼠肾组织中ｐＳＴＡＴ３和ＳＯＣＳ３的表达
Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测结果显示，Ｎ组ｐＳＴＡＴ３和ＳＯＣＳ３的表达较少，与之相比，ＤＭ组ｐＳＴＡＴ３和ＳＯＣＳ３的表达水平上调；ＳＯＣＳ３质粒注射可使肾组织中ＳＯＣＳ３的表达显著上升并明显抑制ｐＳＴＡＴ３的水平，而空载体无此作用。
２．３糖尿病小鼠肾组织中ＣＫ１８和αＳＭＡ的表达
免疫组化染色显示，Ｎ组ＣＫ１８阳性信号主要定位于肾小管上皮细胞，αＳＭＡ定位于血管壁，ＤＭ组肾小管上皮细胞内ＣＫ１８的信号明显减弱并出现αＳＭＡ的阳性信号，ＳＯＣＳ３质粒注射可明显逆转上述结果，而空载体注射不影响ＣＫ１８和αＳＭＡ的表达（图３）。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法结果亦表明，ＤＭ组αＳＭＡ表达上升而ＣＫ１８表达下降，ＳＯＣＳ３质粒注射可使其缓解，ＲＴＰＣＲ检测ＣＫ１８和αＳＭＡｍＲＮＡ也表现出与蛋白类似的结果。
３讨论
随着糖尿病发病率的上升，作为其常见并发症的糖ＤＮ对人类的影响越来越凸显，严重危害糖尿病患者的健康，甚至生命［４］。ＤＮ的主要病理变化包括肾小球系膜区细胞外基质积聚及肾小球硬化，肾小管上皮细胞转分化及肾间质纤维化［５，６］，进而引起高血压、蛋白尿及肾功能不全，最终导致肾功能衰竭。既往认为ＤＮ的早期病变在肾小球，但近年来的研究发现，在糖尿病肾小球滤过膜发生变化的同时甚或之前，肾小管间质已存在功能损伤，甚至小管间质损害可以预示肾小球滤过率的下降，是糖尿病早期肾损害的标志，也是决定疾病转归的重要因素［７］。肾小管上皮细胞转分化是肾小管间质损害中的重要事件之一，其转变成的肌成纤维细胞是产生细胞外基质、导致肾小管间质纤维化的关键因素［８］。小管细胞转分化表现为自身标志蛋白的丢失并获得间充质细胞标志蛋白，并进而发生一系列形态转变从而进入肾间质。本组实验通过检测ＣＫ１８和αＳＭＡ的表达来反映细胞转分化情况，结果表明，糖尿病小鼠肾组织中小管上皮细胞自身上皮标志蛋白ＣＫ１８的表达明显减少，并出现了肌成纤维细胞的标志蛋白αＳＭＡ的表达。该实验并未观察到典型的转分化形态表现，且未在间质中查见αＳＭＡ阳性细胞。作者考虑可能是小管上皮细胞并未发生完整的形态转变，而只是发生了转分化的趋势。之后的实验，将延长时间做进一步观察。目前已知多条信号转导途径与肾小管上皮细胞转分化有关。如ＴＧＦβ１、Ｎｏｔｃｈ、Ｗｎｔ、ＢＭＰ／ＮＦκＢ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ等信号。大量研究表明，糖尿病肾组织存在ＪＡＫ／ＳＴＡＴ信号的激活［９，１０］，此外，ＳＴＡＴ３的激活被认为与肿瘤浸润、转移密切相关，其机制主要是通过诱导肿瘤细胞转分化［１１，１２］，由此，作者考虑抑制ＳＴＡＴ３的激活或许能缓解糖尿病肾小管间质病变。ＳＯＣＳ是ＳＴＡＴ诱导的靶蛋白之一，可与ＪＡＫ结合并抑制ＪＡＫ激酶的催化活性或者介导ＪＡＫ的泛素化降解进而下调ＳＴＡＴ的活化。ＳＯＣＳ家族包括８个成员（ＳＯＣＳ１～７和ＣＩＳ），其中ＳＯＣＳ３主要抑制ＳＴＡＴ３的激活。本组前期体外研究表明，ＳＯＣＳ３可抑制肾小管上皮细胞转分化［１３］。本组实验进行了体内验证，收集成模后１２周的糖尿病小鼠肾组织，尽管糖尿病小鼠肾组织中ＳＯＣＳ３的表达高于对照鼠，但与４或８周时相比，ＳＯＣＳ３的表达逐渐降低。因此作者认为糖尿病形成时ＳＴＡＴ的激活诱导了ＳＯＣＳ３的高表达，但随病变时间延长其表达下降，不足以抑制ＳＴＡＴ３的活化，因此考虑通过体外干预进一步提升ＳＯＣＳ３的表达或许能有效抑制ｐＳＴＡＴ３的表达从而缓解肾损伤。本实验应用转染试剂ＴｒａｎｓＩＴＥＥＨｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃＤｅｌｉｖｅｒｙＳｏｌｕｔｉｏｎ介导进行ＳＯＣＳ３基因体内转染，转染后肾组织中ＳＯＣＳ３蛋白表达明显增强，提示转染成功并在蛋白水平获得高效表达。之后进一步检测了ＳＯＣＳ３对糖尿病小鼠肾小管上皮细胞转分化的影响，结果显示，肾组织过表达ＳＯＣＳ３可抑制ＳＴＡＴ３的磷酸化，同时抑制αＳＭＡ并恢复部分ＣＫ１８的表达，提示以ＳＯＣＳ３为靶点对糖尿病进行治疗，可能通过抑制ＳＴＡＴ３的激活进而抑制肾小管上皮细胞转分化从而改善糖尿病肾小管间质病变。
作者：高翔 单位：河北医科大学第二医院血管外科
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