1SUMO表达系统的优势
越来越多的融合标签在融合表达中成功应用，这是因为融合标签不仅具有促进目的蛋白表达特性，而且还能屏蔽某些毒性蛋白对宿主菌毒性和防止目的蛋白降解［25］。自2004年以来，SUMO作为融合标签越来越多地用于表达系统中。SUMO比传统的融合标签如硫氧还蛋白、绿色荧光蛋白、麦芽糖结合蛋白等具有更大的优势，除了具有传统融合标签的促进可溶性的特性外，还具有分子伴侣功能，能促进目的蛋白的正确折叠等特点［26］，同时对热和蛋白酶有很强的抗性，有利于保持目的蛋白的稳定性［12，26，27］。此外，SUMO分子量相对于绿色荧光蛋白、麦芽糖结合蛋白和谷胱甘肽-S-转移酶等融合标签较小，表达融合蛋白中目的蛋白占比例较大，能够有效提高切割效率［5］（表1）。SUMO融合标签的更大的优势在于其具有与其配套的SUMO蛋白酶1。SUMO蛋白酶1具有较强的专一性，它所识别的区域并非其他丝氨酸蛋白酶或化学试剂的一级序列，而是蛋白质的三维结构，因此导致其切割效率高而且不具有非特异性［29］。SUMO蛋白酶1识别SUMO三级结构后，能从SUMO末端的双甘氨酸处将目的蛋白从融合蛋白上切割下来，不存在任何氨基酸残留［30］，因而较适用于表达天然序列的重组蛋白［39］。Malakhov等［29］研究表明，SUMO蛋白酶Ⅰ可在较广pH范围（5.5-10.5）及温度（4-37℃）范围内将SUMO从SUMO-GFP融合蛋白上切割下来，且SUMO蛋白酶Ⅰ对蛋白质纯化过程中用到的试剂，如咪唑、Triten、脲、盐酸胍等不敏感，甚至在2mol/L脲的溶液中能成功切割SUMO-GFP融合蛋白，简化了蛋白质纯化过程［29，39］。这相比于其他蛋白酶，如TEV蛋白酶、FactorXa、肠激酶等具有显著优势（表2）。Marblestone等［5］对SUMO融合标签与传统的His6标签、泛素（Ub）蛋白标签、麦芽糖结合蛋白（MBP）标签、谷胱甘肽-S-转移酶标签、NusA及硫氧还蛋白标签作了比较发现，其中NusA和SUMO能最大程度促进绿色荧光蛋白（GFP）、基质金属蛋白酶-13（MMP13）和肌肉生长抑制素（GDF8）可溶性表达，同时比较了SU-MO蛋白酶与TEV蛋白酶的切割效率，动力学分析发现SUMO蛋白酶与TEV蛋白酶具有相同的Km，但SUMO蛋白酶的Kcat值比TEV蛋白酶高25倍，说明SUMO蛋白酶的切割效率更高。类似的泛素（Ubiqu-itin）融合系统也具备SUMO融合系统的诸多优点［29，36］，但切除泛素标签的去泛素化酶DUBs不稳定，不易生产和廉价制备［29］。另外，去泛素化酶的切割效率低下，需要去泛素化酶与底物的摩尔比高达1∶10才能取得良好的切割效果［36］；而且大肠杆菌中存在一种内源性泛素蛋白酶ElaD，特异性切割泛素融合蛋白，使得泛素标签作用失去意义［40，41］。Peroutka等［28］详细系统地阐述了SUMO表达体系在大肠杆菌表达系统中的应用，包括载体构建、诱导表达、融合蛋白的纯化和切割等，为SUMO表达体系的应用提供了参考。因此，SUMO融合技术已成为目前大肠杆菌重组蛋白表达和纯化的重要手段。
2SUMO在毒性蛋白质表达中的应用
由于SUMO表达系统的优势，目前已经使用SUMO蛋白酶切割了大约100个SUMO融合蛋白，均未发现其在靶蛋白内错误切割［30，49］。因此SUMO融合表达系统的应用具有广阔前景。3.1SUMO在原核表达系统中的应用SUMO融合表达系统广泛应用于以大肠杆菌为代表的原核表达系统。Li等［52］在大肠杆菌BL21（DE3）中实现阳离子抗菌肽CM4与SUMO的融合表达，使用SUMO蛋白酶1进行了成功的切割，切割效率达90%以上，CM4产量达24mg/L，产量分别是使用羟胺切割硫氧还蛋白的2倍［50］、使用甲酸切割硫氧还蛋白的20倍［51］和利用内含肽表达的5.7倍［53］。另外，对大肠杆菌具有毒性的阳离子抗菌肽IDR1、MX226、LL37、CRAMP、HHC-10、E5和E6均使用SUMO融合表达系统实现表达，有效屏蔽了抗菌肽对宿主菌的毒性及蛋白酶降解［54］。SUMO也应用于多聚体表达，使CM4二聚体表达量提高一倍［55］。此外，SUMO也可以与其他融合标签共同使用。Li［56］使用SUMO和硫氧还蛋白双融合标签成功表达了人抗菌肽LL-37。SUMO融合表达在枯草芽孢杆菌表达系统中同样得到很好的应用。Chen等［57］成功构建一个SUMO-SUMO蛋白酶枯草芽孢杆菌表达系统，其共表达的SUMO蛋白酶1能自动切割掉SUMO-天蚕素AD融合蛋白上的SUMO标签，分泌产物为已完成切割的天蚕素AD，简化了蛋白纯化步骤，有效提高天蚕素AD表达量，产量为30.6mg/L，是Yang等［58］表达天蚕素AD的2.55倍。张贞等［59］使用EDDIE作为融合标签表达的天蚕素AD为包涵体形式，验证了SUMO促进蛋白质可溶性的特性。3.2SUMO在真核表达系统中的应用真核生物细胞内存在内源SUMO蛋白酶，其可以在翻译后修饰过程中识别并切割SUMO融合蛋白，导致无法实现SUMO直接应用于真核表达系统［28，30］。为了解决内源SUMO蛋白酶切割问题，Butt等［38］研究出一种有效屏蔽内源性SUMO蛋白酶识别的切割系统，即将SUMO蛋白切割为N端（NTHS）和C端（CTHS），CTHS能促进蛋白质在真核表达系统中表达，不被其内源SUMO蛋白酶识别。CTHS融合蛋白与NTHS在一定条件下可通过强疏水相互作用实现SUMO完整结构的重构。SUMO蛋白酶可以识别重构后的SUMO蛋白结构并在CTHS末端实现切割，释放目的蛋白［30］。此外，为进一步突破SUMO在真核表达系统中面临的障碍，Lifesensors公司（www.lifesensors.com）相继开发出SUMOstar、SUMOpro融合表达系统，可同时应用于原核与真核表达，并开发出了相对应的蛋白酶：SUMOstar蛋白酶1和SUMOpro蛋白酶2。Liu等［60］使用SUMOstar融合系统实现鼠UBP43、人类胰蛋白酶βⅡ、USP4、USP15和绿色荧光蛋白在昆虫内表达，证明SUMOstar可以很好地阻止细胞内源性SUMO蛋白酶的切割并均极大促进了以上蛋白的表达。SUMOstar-GFP融合蛋白的表达量是单体GFP的6倍以上，SUMOstar-人胰蛋白酶βⅡ表达量是非融合蛋白的3倍以上。尽管SUMO显示了良好优势，但它并不对所有蛋白都适用。Xie等［61］使用SUMO标签蛋白融合表达抗菌肽OG2，并没显示出比硫氧还蛋白及内含肽具更大优势。且SUMO对人利尿素的可溶性融合表达方面也不及硫氧还蛋白［39］。有关SUMO的应用还需进一步研究。
3结语
融合表达技术在一些蛋白质表达中取得了成功，但是对于其规模化应用还存在一些限制，如蛋白产量、切割效率、非特异性切割、切割后有氨基酸残留等。由于SUMO具有促进蛋白可溶性表达、正确折叠，防止蛋白降解及SUMO蛋白酶切割后目的蛋白N端无氨基酸残留的优势，预期SUMO及相关系统在原核与真核表达系统中具有较好的应用前景。
作者：汪小杰 毛若雨 张勇 滕达 王秀敏 王建华 单位：中国农业科学院饲料研究所
