1蛋白质印迹(WesternBlotting)
本实验所用之Anti-GAPDH及anti-Bcl-xL是来自abcam(England)。将经过治疗或未治疗的细胞离心后去除上清液，以100μL(ＲIPA+proteinaseinhibitor)回溶并打散细胞，再以液态氮降温、室温回温共四个循环打破细胞，取其上清液。100μLBradford(Bio-Ｒad)加入96-well孔盘，每个well加2μL样本上清液，室温作用5min后，以光谱分析仪(Ｒ607-1)测量蛋白质浓度，设定波长为595nm，每个样本在蛋白质定量之后，浓度皆为2μg/mL。将定量完成的蛋白质，依体积加入5xdye，其余体积补ＲIPA。将样本置于水浴95℃，放置10min。将样本依序加入wells中，并加入pro-teinladder10μL，上层胶约跑30min，电压为60V;下层胶约跑50min，电压为100V。将WesternMembrane放置胶上，并再盖上2片filterpaper;翻面打开胶并再盖上2片filterpaper，并再两侧加上海绵填充物，置放入transfer模具中，压紧transfer模具置入跑胶器中，加入transferbuffer(3.04g_Tris，14.28g_Glycine，200mL_100%Meth-anol，andaddedddH2Oto1L)。将电源供应器及跑胶器置于4℃冰室中，连接好并设定100V，时间为60min。将westernmembrane取出，置于保鲜盒中，并加入5%脱脂牛奶，进行blocking，放置摇摇板中，转速为60rpm，常温中反应1h(5%nofatmilk:20mLPBSTand1gnofatmilk)。配置1stantibody(1:1，000)于5%脱脂牛奶中。blocking完成后，将5%脱脂牛奶倒掉，加入5%脱脂牛奶清洗，共清洗3次，每次5min。加入1stantibody于westernmembrane上，放置4℃冰箱的摇摇板上，转速为60rpm，反应过夜。隔天回收1stantibody保存于4℃冰箱中，并加入PBST清洗，共清洗6次，前4次8min，后2次5min。(PBST:40gNaCl，1gKCl，7.2gNa2HPO4，1.2gKH2PO4，addedddH2Oto5L，andadded5mLTween20)。配置2ndantibody(比例一般先尝试使用1∶25000)于5%脱脂牛奶中。将westernmem-brane放置parafilm上，加入配置好的2ndantibody，放置摇摇板上，转速为60rpm，反应90min于常温中。加入PBST清洗，共清洗6次，前4次8min，后2次5min。将清洗好的westernmembrane放置干净的暗盒上，加入HＲPsubstrate(PeroxideSolu-tion+LuminolＲeagent)(Millipore)，于常温中反应10min后，至暗室加入底片并完成成相。
2结果
2.1艾叶萃取物对子宫颈癌细胞的影响
如图1所示，与对照组(DMSO、Medium)相比，加入越高浓度艾叶萃取物的组别，其HeLacells的细胞数量越少。显示艾叶萃取物能够对He-Lacells的生长产生影响，并且与艾叶萃取物的浓度呈现正相关。
2.2艾叶萃取物造成子宫颈癌细胞早期凋亡
为了确认子宫颈癌细胞早期凋亡的情况，以流式细胞技术(FlowCytometry)测量AnnexinVposi-tive的比例。结果显示(图2)对照组(DMSO、Medium)AnnexinVpositive的比例为3.15%与2.96%。在实验组方面，随着提高艾叶萃取物的浓度，AnnexinVpositive的比例逐渐增加，分别为2.92%、3.97%、8.76%、7.08%、13.1%、19.8%，实验组AnnexinVpositive的比例皆超过对照组。显示艾叶萃取物确实能够造成子宫颈癌细胞早期凋亡。
2.3艾叶萃取物對子宫颈癌细胞表現Bcl-xl的影响
以WesternBlotting确认各组Bcl-xl的表达量(图3)，发现越高浓度的艾叶萃取物有越低的Bcl-xl表达量。此结果可以说明艾叶萃取物透过mito-chondriapathway引发子宫颈癌细胞凋亡。
3讨论
在早期细胞凋亡时，部分粒线体内膜层(Phosphatidylserine)会外翻至外膜层，因此，藉由AnnexinV与粒线体外翻内膜层(Phosphatidyl-serine)的结合，可以侦测到细胞早期凋亡的情形。回顾本研究结果，以流式细胞技术(FlowCytome-try)侦测AnnexinV与PI，侦测粒线体内膜。发现艾叶萃取物浓度越高，AnnexinV阳性比例亦越高，显示艾叶萃取物能够造成粒线体内膜外翻等细胞凋亡的早期现象。细胞凋亡的机制至少包含两种:Mitochondriapathway与FASpathway。其中，Mitochondriapath-way藉由活化Bak、Bad、Bid及Bax，促使粒线体内膜外翻并释放出cytochromeC，进一步造成细胞凋亡。其中，Bcl-2与Bcl-xl会藉由抑制cytochromeC的释出以阻止apoptosis的发生［9，10］。一般将Bcl-2family分成两类:Bak、Bad、Bid属于亲凋亡类(Pro-apoptoticClass);Bcl-2、Bcl-xl为抗凋亡类(Anti-apoptoticClass)。另外，引起细胞凋亡的蛋白质包含Bax和Bim等［11］。本实验以WesternBlotting确认各组Bcl-xl的表达量，发现艾叶萃取物浓度越高，抑制cytochromeC释出的Bcl-xl表达量则越低，表示艾叶萃取物确实经由Mitochondriapathway引发HeLacells的凋亡。综合上述，艾叶萃取物确实能够引发HeLacells的凋亡，并且藉由Bcl-xl的表达量被抑制的结果，可以说明引发HeLacells凋亡的机制应该是mitochondriapathway，但需要更进一步的实验结果才能充分证实。
作管理期刊者：陈怡斌 邱健泰 李宗谚 单位：台湾长庚大学 台湾长庚纪念医院中医部 台湾长庚大学生物医学系 台湾林口长庚纪念医院
