1材料和方法
1．1材料子宫颈癌细胞株HeLa细胞和人脐静脉内皮细胞株购于美国ATCC公司;Akt抑制剂Tricirbine购于Sigma公司;血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)、白细胞介素-8(interleukin-8，IL-8)、趋化因子1［chemokine(C-X-Cmotif)ligand1，CXCL1］和基质金属蛋白酶9(matrixmetalloprotein9，MMP-9)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购于欣博盛生物科技有限公司;基质胶购于美国BD公司;胰酶、DMEM/F-12基础培养液和胎牛血清购于美国Hyclone公司。
1．2精浆的提取精液来自于丰润区第二人民医院的10位健康男性，年龄18～25岁，平均年龄为21．3岁，中位年龄为22岁。提取的精液通过密度梯度离心分离出精浆，之后置于－80℃的冰箱中保存。细胞实验中将分离出的精浆1∶100稀释使用。
1．3细胞培养HeLa细胞置于DMEM/F-12基础培养液加10%的胎牛血清中进行培养。取对数期的细胞，分成3组:对照组、精浆组和精浆加Akt抑制剂组。刺激24小时后，弃培养液上清，PBS洗3次后，加入新鲜的培养液。继续培养48小时，提取上清。ELISA实验用来检测上清中的VEGF、IL-8、CXCL1和MMP-9的含量，操作严格按照说明书进行。
1．4基质胶血管生成实验96孔板每孔加入100μL预冷的基质胶，之后置于37℃孵箱中备用。取对数期生长的内皮细胞，胰酶消化后按照之前提取的上清分组制成密度为1×105的细胞悬液，上清与细胞培养液的比值为1∶3。将细胞悬液加入提前处理好的96孔板中，每孔为100μL，之后置于孵箱中培养。24小时后显微镜下观察血管生成的情况。1．5统计学分析应用SPSS12．0统计软件分析。统计结果采用t检验。P＜0．05为差异有统计学意义。
2结果
2．1精浆对HeLa细胞血管生成因子分泌作用的影响ELISA实验结果显示，精浆可以促进HeLa细胞分泌IL-8和CXCL1，使其含量分别增加185．3%和148．7%，Akt信号通路的阻断则可以抑制这一效果，使其含量相对于精浆组分别下降61．4%和42.7%，差异均有统计学意义(均P＜0．05)。精浆的处理对HeLa细胞VEGF和MMP-9的分泌均无显著影响(均P＞0．05)。
2．2HeLa细胞分泌上清对内皮细胞血管生成的影响基质胶血管生成实验结果显示，对照组每个视野平均有2个血管网格形成，精浆组有9个血管网格形成，两者之间差异有统计学意义(P＜0．05);精浆加Akt抑制剂组只有4个血管网格形成，与精浆组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。
3讨论
血管生成在肿瘤的发生和转移中发挥着十分重要的作用，其活跃程度是肿瘤的组织病理分级和预后判断的重要指标［3］。本研究发现精浆可以促进子宫颈癌细胞分泌IL-8和CXCL1等促血管生成因子，而这些因子被认为是细胞增殖、血管生成和肿瘤转移的重要调控因素。此外Sales等［4］进行裸鼠移植实验结果发现，精浆还可以激活子宫颈癌的慢性炎性反应，促进肿瘤的发展。因此，对于检测出子宫颈癌或者子宫颈癌前病变即子宫颈重度上皮内瘤样病变的女性患者，应该减少甚至杜绝精液的反复接触，以降低精浆对子宫颈癌发展的促进作用。Akt是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，约由480个氨基酸残基组成，其与血管生成紧密相关。Akt可以通过微丝附着梁蛋白(girdersofactinfilaments，Girdin)来促进内皮细胞的增殖和迁移，此外Akt还能通过促进血管内皮生长因子(VEGF)和低氧诱导因子(hypoxiainduciblefactor-1，HIF-1)等细胞因子的分泌来调控血管生成［5］。本研究发现，Akt信号通路的阻断大大降低精浆诱导的促血管生成因子的分泌，同时精浆加Akt抑制剂组内皮细胞形成血管网的能力也大幅度降低，这说明Akt信号通路可能是精浆促进子宫颈癌细胞分泌促血管生成因子的重要途径，可以作为肿瘤血管靶向治疗的一个重要靶点，为临床抗肿瘤药物的研发提供新的途径。综上所述，本研究结果表明，精浆可以促进子宫颈癌细胞分泌促血管生成因子，进一步调控肿瘤的血管生有价值的的经济期刊成，Akt信号通路在这个过程中发挥着十分重要的作用。
作者：王雅红 单位：丰润区第二人民医院妇产科
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