１ＣＣＫ－８法检测细胞增殖抑制率
稀释细胞使其浓度为（１～５）×１０４个细胞／ｍＬ培养液，分别取１００μＬ至９６孔培养板，每种细胞每块板接种３个同样的孔作为复孔，（１～５）×１０３个细胞／孔，以１００μＬ培养液做空白对照，３７℃培养过夜。按实验设计分组加入不同浓度的ＰＦ０４２１７９０３，培养４８ｈ，终止培养，每孔加入ＣＣＫ－８溶液１０μＬ，３７℃孵育４ｈ。以空白孔调零，酶联免疫检测仪检测４５０ｎｍ波长处的每孔吸光度值（Ａ值），计算抑制率（ＩＲ），ＩＲ＝（对照孔Ａ值－实验孔Ａ值）／对照孔Ａ值×１００％。实验重复３次，结果取均值。
２结果
各组吸光度值见表１。胰腺癌细胞株ＣＦ－ＰＡＮＣ－１在给予５０ｎＭ～２０μＭ浓度的药物ＰＦ０４２１７９０３培养４８ｈ后，不同浓度的药物对细胞株的增殖均有影响（Ｆ＝８１．０１，Ｐ＜０．０５）（图１）。在相同时间和浓度下，对胰腺癌细胞株ＳＷ１９９０增殖无明显影响（Ｐ＞０．０５）（图２）。
３讨论
胰腺癌是目前恶性肿瘤中恶性程度较高的肿瘤，一般发现时已是晚期，总体５年生存率只有５％左右，且放、化疗对胰腺癌治疗不敏感［２－３］。吉西他滨是目前治疗胰腺癌的首选药物，但吉西他滨防止术后转移以及晚期转移的治疗效果并不理想。迄今为止，尚无一种方案的疗效能够显著优于吉西他滨单药治疗。目前研究表面恶性肿瘤难以彻底治愈的原因是肿瘤细胞易出现转移，难以全部杀灭。研究阐明恶性肿瘤的转移是基于肿瘤干细胞来实现的，而肿瘤干细胞具有ＥＭＴ的特性。近年来在病理方面的研究表明，ＥＭＴ可以促进肿瘤浸润和转移［１］。在乳腺癌、横纹肌肉瘤和骨肉瘤里都能发现ＨＧＦ／Ｃ－ＭＥＴ的表达过程［４］。此外，ＨＧＦ／Ｃ－ＭＥＴ在内皮细胞通过促血管生长因子或通过调控分泌ＶＥＧ－ＦＡ、白介素８等调控肿瘤血管的生成［５］。ＸＬ１８４（卡博替尼）为Ｃ－ＭＥＴ和ＶＥＧＦ抑制剂，利用心内注射胰腺癌细胞的模型，ＸＬ１８４几乎完全阻断了胰腺癌转移的发生［６］。Ｓｅｎｎｉｎｏ等使用ＲＩＰ－Ｔａｇ２转基因胰腺神经内分泌癌小鼠研究发现，ＸＬ１８４和Ｃ－ＭＥＴ抑制剂ＰＦ０４２１７９０３联合使用可减少侵袭和转移［７］。这项研究和Ｌｉ等的实验结果一致［８］：利用ＸＬ１８４抑制Ｃ－ＭＥＴ可有效地阻断肿瘤转移。这项研究还发现抑制ＶＥＧＦ可导致肿瘤细胞Ｃ－ＭＥＴ表达增加，同时可以使ｓｎａｉｌ等ＥＭＴ诱导因子表达上升，表明Ｃ－ＭＥＴ表达和ＥＭＴ的表达具有正相关。抑制Ｃ－ＭＥＴ可以明显降低ＶＥＧＦ抑制剂诱导的ＥＭＴ转录因子ｓｎａｉｌ等的表达，表明了胰腺神经内分泌癌ＥＭＴ和肿瘤转移之间具有相关性［８］。Ｓｅｎｎｉｎｏ等使用ＲＩＰ－Ｔａｇ２转基因小鼠模型后续的研究发现，抑制ＶＥＧＦ导致淋巴转移增加的同时导致淋巴和肿瘤细胞Ｃ－ＭＥＴ和ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｃ－ＭＥＴ明显升高。使用Ｃ－ＭＥＴ抑制剂ＰＦ０４２１７９０３可显著降低肿瘤的淋巴转移，并且单独使用Ｃ－ＭＥＴ抑制剂ＰＦ０４２１７９０３阻断肿瘤转移的效果最佳，这项研究和Ｌｉ等的实验结果基本一致［８］。
因此在这项研究中我们使用特异性的Ｃ－ＭＥＴ抑制剂ＰＦ０４２１７９０３来抑制Ｃ－ＭＥＴ通路。ＰＦ０４２１７９０３是一种强效的选择性ＡＴＰ竞争性Ｃ－ＭＥＴ抑制剂，ＰＦ－０４２１７９０３和Ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ联用作用于抗Ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ的ＥＬ４和ＬＬＣ肿瘤模型，与两者分别单独给药相比，通过显著阻断血管扩张而显著抑制肿瘤生长，说明作用于抗Ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ的肿瘤时关键是作用于ＨＧＦ／Ｃ－ＭＥＴ轴［９］。在其肿瘤模型中的研究中发现，Ｃ－ＭＥＴ是由不同的机制包括Ｃ－ＭＥＴ的基因扩增、ＨＧＦ／Ｃ－ＭＥＴ的自分泌环活化形成和Ｃ－ＭＥＴ的过表达活化的［１０］。本实验为了实验结果的科学性和合理性，采用了药物敏感细胞株ＣＦＰＡＣ－１和中等耐药的细胞株ＳＷ１９９０，结果发现在培养４８ｈ的情况下，５０ｎＭ及以上浓度的ＰＦ０４２１７９０３抑瘤效果有统计学意义，而ＳＷ１９９０即使在２０μＭ的浓度下也未表现出抑瘤效果，考虑为试验的时间及细胞株选择上考虑不周到。为了能够进一步研究ＰＦ０４２１７９０３对胰腺癌的临床意义，下一步我们准备继续选择几种胰腺癌细胞株，并准备在２４ｈ、４８ｈ和７２ｈ时间下进行试验，同时在该试验结果的基础上，进一步摸索相关浓度，进行Ｑ－ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｏｎ－ｂｌｏｔ实验探明ＰＦ０４２１７９０３对胰腺癌细胞株具体ＥＭＴ通道的影响，以探究该药物阻断胰腺癌ＥＭＴ和转移的机理，为临床胰腺癌找寻新的治疗思路，实现防止胰腺癌转移、提高胰腺癌治美国农业论文疗效果打下坚实的理论基础。
作者：傅俊凯 李贵新 马晓林 单位：潍坊医学院
