前列腺癌发病隐匿，早期诊断较为困难，雄激素去势治疗／抗雄激素治疗是目前治疗复发或者转移性前列腺癌的主要方法，但超过一半的患者会复发并转化为雄激素非依赖性前列腺癌（androgenindependentprostatecancer，AIPC），侵袭转移和扩散能力增强［3］，常易出现骨转移。而目前对于前列腺癌发生发展，尤其是其侵袭转移的分子机制仍未完全清楚，对晚期转移癌的患者尚无有效治疗手段，预后较差。前列腺特异膜抗原（prostate-specificmembraneantigen，PSMA）在前列腺癌中具有较高的组织特异性，其作为前列腺癌较特异的生物学标志物以及诊断和治疗的潜在应用前景受到了广泛关注［4］，PSMA在前列腺癌中的高表达及其与病理分级、预后因素的相关性提示PSMA在前列腺癌的发生发展以及转移过程中可能起着一定的调控作用［5］。本文通过对PSMA基因特异性沉默的LNCaP细胞株，不表达PSMA的PC-3细胞株和正常表达PSMA的LNCaP的前列腺癌细胞株一起进行肿瘤转移相关基因表达差异分析，最后筛选出并验证与前列腺癌细胞转移相关的基因。旨在为探索前列腺癌的发病机制提供新的思路，从而为临床肿瘤的转移诊断、预后及治疗提供理论参考。
1材料与方法
1．1材料
1．1．1前列腺癌细胞株前列腺癌细胞株LNCaP、22RV1、PC-3和DU145均购于ATCC（美国模式物种集存库），特异性沉默PSMA的siRNA-PSMA-LNCaP细胞株为实验室其他课题组制备并验证。1．1．2临床样品前列腺组织临床标本均由中山大学附属第一医院泌尿外科提供，手术取下的标本立即置于RPMI1640＋10％FBS细胞培养液中，4～8℃低温条件运送到实验室，于－80℃冻存直至用于实验。本课题共收集了85例前列腺组织临床样品，其中包括12例正常前列腺组织，26例良性前列腺肥大组织（BPH）和47例前列腺癌组织，前列腺癌组织又根据Gleason分值划分为ProstatecancerGleasonscore4，5，6和ProstatecancerGleasonscore7，8，9两组。1．1．3主要试剂和仪器RPMI1640基础培养基、胎牛血清和双抗购于美国GIBCOBRL公司；Trizol裂解液、反转录试剂盒SuperscriptⅢ和SYBRGreen购于Invitrogen公司；氯仿、异丙醇、75％酒精和DEPC水购于生工生物工程（上海）股份有限公司；高速低温离心机、Mastercyclereprealplex2荧光定量PCR仪和移液枪购于德国eppendorf公司；CO2培养箱购于Thermo公司；生物安全柜购于BAKER公司。
1．2方法
1．2．1细胞株培养实验过程中所用到的细胞株用含10％胎牛血清和1％双抗的RPMI1640培养基，于37℃、5％CO2培养箱进行培养。1．2．2肿瘤转移基因芯片分析提取用于芯片分析的3种前列腺癌细胞株总RNA，步骤如下：向细胞沉淀中加入500μlTrizol细胞裂解液，室温裂解10min后向细胞裂解液中加入200μl氯仿，振荡混匀后室温放置10min；4℃，12000rpm离心10min；小心将上层清夜吸出，并加入500μl异丙醇，上下轻轻颠倒10次，室温放置10min后4℃，12000rpm离心10min；弃上清，用1ml75％酒精洗涤沉淀，离心得到沉淀后加入30～50μlDEPC水溶解沉淀。对得到的RNA浓度和纯度进行测定，符合要求的RNA送康成公司利用美国SABiosciences公司进行肿瘤转移基因芯片分析：［PCRArrayHumanTumorMetastasis（PAHS-028A），http：／／www．kangchen．com．cn／Produet／Productmain．asp？ID＝41］。该芯片采用荧光定量PCR原理，具有高灵敏度、高特异性、重复性好和线性范围广的特性，是研究特定信号通路或者一组功能相关基因表达量的理想方法。1．2．3细胞株中验证芯片结果细胞株总RNA提取方法与1．2．2一致，得到的RNA用反转录试剂盒合成cDNA，操作步骤严格按说明书进行。随后，用Real-timePCR检测的方法，在PMSA表达（LNCaP和22RV1）和不表达（PC-3和DU145）的前列腺癌细胞株中验证芯片结果。检测序列如下：PSMA-F5′-GAAGTCTCAAAGTGCCCTACAATG-3′，PSMA-R5′-ACCCATGAGTCCCGGTGAC-3′。反应体系如下：SYBRGreenMix10μl，cDNA2μl（5ng／μl），ForwardPrimer（2μmol／L）2μl，ReversePrimer（2μmol／L）2μl，RNase-freeH2O4μl。反应程序如下：95℃3min，95℃10s，65℃35s，第二步开始40个循环。1．2．4临床标本中验证芯片结果将收集到的标本剪切成约0．5cm的小块，按体积比10∶1加入Trizol裂解，然后进行RNA提取和芯片结果验证，步骤与1．2．3一致。1．2．5数据分析：采用ΔΔCt方法计算每个处理组中的肿瘤转移相关基因的ΔCt：ΔCt（组1）＝靶基因平均Ct－内参基因平均Ct；ΔCt（组2）＝靶基因平均Ct－内参基因平均Ct。计算2个PCRArray中每个基因的ΔΔCt：ΔΔCt＝ΔCt（组2）－ΔCt（组1），通常组1是对照组，组2是实验组。通过2－ΔΔCt计算组2与组1对应基因的表达差异。
1．3统计学分析
差异比较采用SPSS21．0软件进行检验，定量资料进行单因素方差分析，方差不齐者采用秩和检验分析，样本间的两两比较采用LSD方法分析。P＜0．05为差异有统计学意义。
2结果
2．1肿瘤转移基因芯片结果
与LNCaP细胞株相比，特异性沉默PSMA的siRNA-PSMA-LNCap细胞株中有10个表达明显上调的基因，见表1；不表达PSMA的PC-3细胞株中有21个表达明显上调的基因，见表2。MMP3、CDH6和MTSS1表达明显上调，见表3。
2．2前列腺癌细胞系中验证差异基因的表达
在前列腺癌细胞株中比较基因芯片结果中筛选到的3个基因：MMP3、CDH6和MTSS1，见图1，3种基因在PSMA阳性细胞株（LNCaP和22RV1）中的表达显著下调（P＜0．05）；在不表达PSMA的PC-3细胞株中表达显著上调（P＜0．05）；MMP3在PSMA阴性的DU145细胞株中表达显著上调（P＜0．05），但CDH6和MTSS1基因变化趋势与芯片结果不一致，未发现芯片中的变化趋势。
2．3前列腺临床组织样品中检测差异基因的表达
3种基因在正常前列腺组织和良性前列腺肥大组织的表达组显著高于前列腺癌组织（P＜0．05），且与癌症分级呈负相关（MMP3：r＝－0．5826，P＜0．005；MTSS1：r＝－0．4727，P＜0．0001；CDH6：r＝－0．4774，P＜0．0001）；同时PSMA表达越高，3种基因的表达水平越低，表达水平呈负相关（MMP3：r＝－0．6811，P＜0．05；CDH6：r＝－0．5430，P＜0．05；MTSS1：r＝－0．5540，P＜0．05）。3种前列腺癌细胞转移相关基因的表达水平与前列腺癌临床分级和PSMA的表达均呈负相关趋势，见图2。
3讨论
前列腺癌是男性泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤之一，其发病隐匿，早期诊断较为困难，雄激素去势治疗／抗雄激素治疗是目前治疗复发或者转移性前列腺癌的主要方法，但超过一半的患者会复发并转化为雄激素非依赖性前列腺癌，侵袭转移和扩散能力增强，常易出现骨转移。而目前对于前列腺癌发生发展，尤其是其侵袭转移的分子机制仍未完全清楚，对晚期转移癌的患者尚无有效治疗手段，预后较差。前列腺特异膜抗原在前列腺癌中具有较高的组织特异性。其作为前列腺癌较特异的生物学标志物以及诊断和治疗的潜在应用前景受到了广泛关注，PSMA在前列腺癌中的高表达及其与病理分级、预后因素的相关性提示PSMA在前列腺癌的发生发展以及转移过程中可能起着一定的调控作用。本文利用肿瘤转移基因芯片技术，对特异性沉默PSMA的siRNA-PSMA-LNCaP细胞株、不表达PSMA的PC-3细胞株和正常表达PSMA的LNCaP的前列腺癌细胞株进行肿瘤转移相关基因表达差异分析，从中筛选出MMP3、CDH6和MTSS1等3个可能调控前列腺癌细胞转移的基因。最后通过检测了85例临床组织样品中MMP3、CDH6和MTSS1的表达情况，证实3种前列腺癌细胞转移相关基因的表达水平与前列腺癌临床分级和呈负相关趋势。可能参与了由PSMA介导的前列腺癌细胞的转移。基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinase，MMP）是一组锌与钙离子依赖性的肽链内切酶，MMP3也叫间充质溶解素。多种细胞在被适当的刺激后，都可以表达MMP3。MMP3在机体内表达的变化和活性的异常参与了多种疾病的病理过程，特别是肿瘤的发生与发展过程［6］。MMP3细胞粘附分子CDH6，肿瘤转移抑制蛋白MTSS1都和前列腺癌恶性程度以及存活率相关［7－8］。推测PSMA可能参与调控上述3种基因的表达，前列腺癌细胞中PSMA的高表达和这三种基因的表达存在相关性。肿瘤的转移是一个复杂连续的过程，包括瘤细胞的脱落，侵袭和迁移、黏附、局部生长等［9］，这一过程涉及许多复杂因素，在肿瘤的进展过程中调控这些过程基因的表达也在相应变化着影响其进展，使肿瘤向周围侵袭转移。目前报道的与肿瘤转移调控有关的基因有很多种，在这些基因共同作用下促进肿瘤不同进程的发生。因此，需要系统地分析这些基因才能阐明肿瘤转移的分子机制。本研究通过肿瘤转移基因芯片对3种前列腺癌细胞系的RNA进行肿瘤转移基因芯片分析。筛选出3种可能参与调控前列腺癌细胞转移的基因：MMP3、CDH6和MTSS1。并通过实验验证其表达水平与前列腺癌临床分级和PSMA的表达呈负相关，可能参与了由PSMA介导的前列腺癌细胞的转移。研究结果将为更深入地研究PCa的诊断和治疗，以及PSMA的功能及调控途径奠定一定的实验基础。这些表达差异的基因在前列腺癌转移的发生及进展过程中所起的作用及企业管理论文相互关系还有待进一步研究。
作者：马建宏 曹开源 徐霖 钟慧玲 张素粉 罗虹娇 庹玖玲 张甜 刘建中 单位：中山大学临床检验标准化研究中心 广东省人民医院
