【摘要】目的：研究不同浓度植物提取物植酸酮在不同作用时间对两种宫颈癌细胞系增殖的影响。方法：以培养基稀释植酸酮妇科清洗装置Ⅱ型1号及2号至相应浓度，采用噻唑蓝（MTT）比色法检测不同药物浓度对宫颈癌HeLa细胞[腺癌，含人乳头状瘤病毒18（HPV18）基因]及Caski细胞（鳞癌，含HPV16基因）不同时间点的增殖抑制率。结果：植酸酮妇科清洗装置Ⅱ型1号及2号试剂对HeLa及Caski细胞增殖的抑制作用具有浓度依赖性和时间依赖性。不同浓度植酸酮妇科清洗装置Ⅱ型1号及2号试剂对HeLa及Caski细胞增殖抑制作用差异有统计学意义（P＜0.05），细胞增殖抑制率随给药浓度增加作用增强，浓度为5860mg/L、5500mg/L细胞增殖抑制率最高。同一给药浓度不同作用时间对细胞增殖抑制率差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论：植酸酮对宫颈癌细胞系增殖具有抑制作用，可为临床上植酸酮抗HPV治疗宫颈病变及宫颈癌提供理论依据。
【关键词】植酸酮；宫颈肿瘤；癌；人宫颈癌细胞；乳头状瘤病毒科
宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤，其发病率占女性所有恶性肿瘤的13%，仅次于乳腺癌[1]。持续性人乳头状瘤病毒（HPV）感染与宫颈癌的发生有关[1]。国内外学者对植物成分化合物抗HPV的药效均进行了大量的实验观察，如植物Bryophyllumpinnata叶提取物[2]、黄连素[3]等，研究提示部分植物或植物提取物存在抗HPV效应。植酸酮是一种植物提取物，前期研究发现，植酸酮治疗高危型HPV感染合并宫颈上皮内瘤样病变（CIN）Ⅰ有显著疗效，并有效抑制宫颈癌HeLa细胞的生长[4-5]。本研究进一步在细胞水平上证实植酸酮对宫颈癌细胞系增殖的影响，以期为临床上植酸酮抗HPV治疗宫颈病变及宫颈癌提供理论依据。
1材料与方法
1.1实验材料与试剂HeLa细胞（南开大学生命科学院刘新奇教授实验室惠赠；腺癌，含HPV18基因）；Caski细胞（中国医学科学院基础医学研究所惠赠；鳞癌，含HPV16基因）；植酸酮妇科清洗装置Ⅱ型（美福康，1号及2号，天津贤博医疗科技有限公司惠赠）。HyCloneRPMI1640培养基、HyClone高糖改良杜氏伊格尔（DMEM/highglucose）培养基、HyClone0.25%胰酶-依地酸（EDTA，北京赛默飞世尔科技有限公司）；Gibco胎牛血清（上海拜力生物科技有限公司）；噻唑蓝（MTT，上海生工生物工程股份有限公司）；二甲基亚砜（DMSO，上海生工生物工程股份有限公司）；CO2细胞培养箱（美国Thermo公司，240i直热式CO2培养箱）；倒置显微镜（日本奥林巴斯公司，CKX41）；离心机（德国eppendorf公司）；酶标仪（美国BioTek公司，Synergy4酶标仪）；微量移液器（2.5μL、20μL、200μL、1000μL，德国eppendorf公司）；各种培养器皿（25cm2培养瓶、75cm2培养瓶、96孔培养板，美国Corning公司）。1.2药物浓度配置培养基稀释植酸酮妇科清洗装置Ⅱ型1号及2号至相应浓度，充分摇匀离心过滤去除细菌及固体成分，1号配制浓度分别为5860mg/L（1∶1）、586mg/L（1∶10）、117mg/L（1∶50）、58.6mg/L（1∶100），2号配置浓度为5500mg/L（1∶1）、550mg/L（1∶10）、110mg/L（1∶50）、55mg/L（1∶100）。1.3细胞培养取对数生长期的HeLa细胞及Caski细胞，培养基分别为DMEM（完全高糖）培养基及1640培养基，37℃5%CO2培养箱中培养24h至细胞贴壁。按细胞种类分别加入不同浓度含1号药（58.6，117，586，5860mg/L）和2号药（55，110，550，5500mg/L）的培养液，设置一个加不含药物培养液的对照组和一个空白调零组，各组均设6个复孔。1.4MTT比色法检测药物对肿瘤细胞生长的影响将上述细胞在不同时间点（24，48，72，96h）分别取出培养板，弃培养液，加入100μL新鲜培养液及10μL0.5%MTT溶液，37℃继续培养4h。小心吸弃上清，避光条件下加入150μLDMSO，低速震荡10min使孔底蓝紫色结晶完全溶解并充分混匀。酶标仪上测定各孔490nm波长下光密度（OD）值。实验重复3次，按抑制率=（1－加药组OD值/对照组OD值）×100%，绘制2种药物不同浓度不同时间对两种宫颈癌细胞的药物抑制率曲线。1.5统计学方法采用SPSS13.0统计软件进行统计分析。定量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用重复测量资料的方差分析进行统计分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1植酸酮妇科清洗装置Ⅱ型1号对HeLa细胞及Caski细胞增殖的影响不同浓度植酸酮妇科清洗装置Ⅱ型1号试剂对HeLa细胞增殖抑制作用差异有统计学意义（F浓度=359.234，P＜0.001），作用时间相同时，细胞增殖抑制率随给药浓度增加作用增强，浓度为5860mg/L细胞增殖抑制率最高。同一给药浓度不同作用时间对HeLa细胞增殖抑制率差异有统计学意义（F时间=625.400，P＜0.001）。给药浓度和作用时间对HeLa细胞增殖具有交互作用（F交互=36.097，P＜0.001）。见表1。不同浓度植酸酮妇科清洗装置Ⅱ型1号试剂对Caski细胞增殖抑制作用差异有统计学意义（F浓度=1305.980，P＜0.001），细胞增殖抑制率随给药浓度增加作用增强，浓度为5860mg/L细胞增殖抑制率最高。同一给药浓度不同作用时间对Caski细胞增殖抑制率差异有统计学意义（F时间=273.527，P＜0.001）。给药浓度和作用时间对Caski细胞增殖具有交互作用（F交互=36.395，P＜0.001）。见表2。2.2植酸酮妇科清洗装置Ⅱ型2号试剂对HeLa细胞及Caski细胞增殖的影响不同浓度植酸酮妇科清洗装置Ⅱ型2号试剂对HeLa细胞增殖抑制作用差异有统计学意义（F浓度=166.043，P＜0.001），细胞增殖抑制率随给药浓度增加作用增强，浓度为5500mg/L细胞增殖抑制率最高。同一给药浓度不同作用时间对HeLa细胞增殖抑制率差异有统计学意义（F时间=912.519，P＜0.001）。给药浓度和作用时间对HeLa细胞增殖具有交互作用（F交互=8.312，P＜0.001）。见表3。不同浓度植酸酮妇科清洗装置Ⅱ型2号试剂对Caski细胞增殖抑制作用差异有统计学意义（F浓度=682.277，P＜0.001），细胞增殖抑制率随给药浓度增加作用增强，浓度为5500mg/L细胞增殖抑制率最高。同一给药浓度不同作用时间对Caski细胞增殖抑制率差异有统计学意义（F时间=1466.032，P＜0.001）。给药浓度和作用时间对Caski细胞增殖具有交互作用（F交互=49.136，P＜0.001）。见表4。
3讨论
目前，宫颈癌已经明确为感染性疾病，HPV疫苗的开发和研制为宫颈癌的防治开辟了新的科研领域。但是对于已经感染HPV的患者，尚无疗效确切的药物。随着研究的进展，中药抗病毒的药效、安全性得到广泛认可，抗病毒确切的分子机制也正在不断揭示。研究表明，HeLa细胞基因组内包含HPV18的基因序列[6-7]。由于HPV病毒颗粒离开宿主细胞后很难存活，HeLa细胞成为了对HPV基因及其转录产物进行研究的常见工具。宫颈癌细胞株Caski源自一位40岁的宫颈鳞癌白人患者小肠肠系膜转移灶，据报道，其含有完整的HPV16序列，每个细胞大约600个拷贝[8-9]。因此，本研究选择这两种细胞为研究对象，通过含植酸酮妇科清洗装置Ⅱ型的培养液对宫颈癌细胞的直接作用，观察药物对HPV感染细胞的体外增殖的影响。本研究发现植酸酮妇科清洗装置Ⅱ型有抑制HPV基因阳性宫颈癌细胞生长的作用，初步探讨了植酸酮妇科清洗装置Ⅱ型抗HPV的可能。同时，由于体内、外环境有显著差异，植酸酮妇科清洗装置Ⅱ型在体内作用的机制是否与体外实验相同及其更深入的分子机制尚需进一步研究。植酸酮妇科清洗装置Ⅱ型为植酸酮妇科清洗装置，由植物提取素植酸酮等制作而成的植物提取物和一次性助推器组成。该产品分为1号和2号两种，前者主要用于清除HPV，后者主要用于治疗后的养护以及治疗作用的巩固。植酸酮妇科清洗装置Ⅱ型活性成分为植物提取素，含植酸、硅酮、黄酮等。前期实验表明植酸酮妇科清洗装置Ⅱ型用于治疗高危型HPV感染合并CINⅠ有显著疗效[4]。在体外实验中植酸酮妇科清洗装置Ⅱ型1号和2号均能有效抑制宫颈癌HeLa细胞的生长[5]。目前已知植酸酮妇科清洗装置Ⅱ型的作用机制包括改变HPV生存的pH值内环境，使HPV病毒衣壳蛋白L1、L2变性坏死，从而阻断其复制；促进宫颈表面微小创口愈合，阻断HPV进入宿主细胞；诱导机体产生HPV免疫，从而防止同种亚型再次感染；促进增生的柱状细胞凋亡，鳞状上皮细胞恢复，CINⅠ、CINⅡ逆转。本研究通过观察不同浓度植酸酮妇科清洗装置Ⅱ型在不同作用时间对不同宫颈癌细胞株增殖的抑制作用，明确了其对含HPV16基因的Caski细胞株和含HPV18基因的HeLa细胞株增殖存在时间和药物浓度依赖性的抑制作用，药物浓度越高，作用时间越长，对肿瘤细胞抑制作用越强。关于植酸酮妇科清洗装置Ⅱ型对不同宫颈癌细胞株是否具有相同的抑制增殖的作用及其作用机制，是否通过影响HPVE6经济投稿三类期刊、E7基因表农村农业论文达降低相应蛋白发挥作用，尚需进一步研究探索。
作者：高晓丽 王侃 田文艳 岳天孚
