1材料与方法
1.1实验材料
人胆管癌QBC939细胞株由解放军医学院实验室提供；采用RPMI1640培养液、FCS胎牛血清、P-S双抗青霉素-链霉素美国（GIBCO公司）进行细胞培养，使用时按89:10:1比例配制成完全1640培养液做工作液；细胞培养板（美国Costar公司）；Src激酶特异性抑制剂PP2（Sigma公司，美国）；兔抗人磷酸化Src单克隆抗体（Tyr416，Millipore公司）；鼠抗人β-actin单克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司）；Transwell侵袭小室（8pm孔径）（Millipore公司）；细胞计数试剂盒-8（CCK-8）（碧云天生物技术研究所）；mRNA试剂盒(QIAGEN公司)；cDNA逆转录试剂盒(Thermo公司)；RT-PCR试剂盒(罗氏公司)。
1.2实验方法
1.2.1细胞培养及实验分组人胆管癌QBC939细胞用含10％胎牛血清和P-S双抗的RPMI1640培养液，置于37℃、体积分数为5％的CO2培养箱内进行培养；常规更换培养液，利用胰酶对细胞消化传代，实验采用处于对数生长期的细胞。实验共设四组，即空白对照组、实验A组、实验B组、实验C组（分别用2.5μmol/L、5.0μmol/L、10.0μmol/L的Src激酶特异性抑制剂PP2处理）。
1.2.2PP2溶液配制Src激酶特异性抑制剂PP2溶解度为20mg/mL，利用DMSO作为溶剂，配制PP2饱和溶液。用含10％胎牛血清的培养液稀释获得50μmol/L的PP2母液进行备用，使用时根据需要再稀释获得不同浓度的工作液进行实验操作。
1.2.3WesternBlotting检测PP2对QBC939细胞Src激酶磷酸化的影响取对数生长期的QBC939细胞分别用2.5μmol/L、5.0μmol/L、10.0μmol/L浓度的PP2处理48h后，以BCA法测定细胞裂解后获取的蛋白含量。取80μgSDS-PAGE，至PVDF膜，5％脱脂奶粉进行非特异性抗原封闭，加入1：500Tyr416，1：200的β-actin作为内参对照，4℃过夜，用含0.1％Tween20TBS洗膜，加入1：1000带有辣根过氧化物酶标记的二抗，室温下反应1h，TBS洗膜后DAB显色并记录。
1.2.4人胆管癌QBC939细胞体外侵袭检测50mg/L基质胶按1：4稀释液包被8μm孔径Transwell小室滤膜的上表面，置于37℃5％CO2培养箱中温育1h，并用L-15水化小室滤膜上下表面。消化并收集细胞，离心去培养液。PBS洗2遍，用含0.1％BSA的L-15培养基重悬细胞，调整密度为1×105/mL细胞悬液。先在小室上层加入4组200μL细胞悬液，混匀后向下室加入600μL10％FBS的L-15培养液。将24孔板置于37℃无CO2培养箱中培养。48h后移出，置于4％多聚甲醛中固定30min，1％结晶紫染色10min，倒置显微镜观察，每组6个视野。实验重复三次。
1.2.5PCR检测mRNA表达取对数生长期的人胆管癌QBC939细胞经PP2处理48h，收集细胞，提RNA，逆转录为cDNA，取各组cDNA，用ddH2O稀释50倍。按要求加入试剂cDNA，正义引物，反义引物和ROX。设定循环：50℃2min，95℃10min，95℃15s，60℃1min，95℃15s，60℃30s，95℃15s。
1.2.6WesternBlotting检测PP2对QBC939细胞侵袭相关分子蛋白表达的影响取对数生长期的人胆管癌QBC939细胞经PP2处理48小时后，收集细胞并对其进行裂解，提取细胞总蛋白，以BCA法测定细胞裂解蛋白含量。吸取定量后的80μg蛋白质，12%SDS-PAGE法进行分离后，转移至PVDF膜，5％脱脂奶粉封闭非特异性抗原，分别加入稀释后的鼠抗人E-cad-herin和CD44一抗，鼠抗人β-actin单克隆抗体进行1：200稀释作为内参对照，4℃反应过夜后，用含0.1％Tween20的TBS洗膜，加入二抗，室温下反应1h，DAB显色并记录结果。
1.3统计学方法
研究数据汇总后采用SPSSl7.0统计软件进行统计分析，收集数据以mean±SD表示，数据经过正态性检验资料，多组间整体比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法及HSD法，显著性水准均取α=0.05。
2结果
实验组p-Src蛋白表达水平明显低于对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）。实验组穿过小室的细胞数显著低于对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）。经PP2处理后，实验组E-cadherinmRNA表达显著增强，而CD44mRNA表达显著降低，差异具有统计学意义（P<0.005）。实验组E-cadherin蛋白水平明显增高，而CD44蛋白水平则显著降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。
3讨论
肿瘤细胞侵袭是一个复杂的过程，随着细胞间粘附性降低，肿瘤细胞脱离其原发部位，散落至其他部位，形成转移灶[12]。研究显示，Src激酶在肺癌、宫颈癌等多种实体恶性肿瘤组织中被活化而过表达，活化后的Src激酶对其下游信号转导分子进行磷酸化，进而影响肿瘤细胞的侵袭能力[13]。PP2是一种pyrazolopyrimidine复合物，能够选择性抑制Src激酶家族，是Src激酶的特异性抑制剂[14]。本研究通过PP2抑制人胆管癌QBC939细胞中Src激酶，观察Src激酶抑制剂PP2对人胆管癌QBC939细胞侵袭能力的作用和机制。结果发现，人胆管癌QBC939细胞中Src激酶处于高活性状态，而用5μmol/L的Src激酶抑制剂PP2可显著抑制QBC939细胞中p-Src的表达（P<0.05）。此外，通过体外侵袭实验我们发现，Src激酶抑制剂PP2抑制QBC939细胞Src激酶的活化后，QBC939细胞的侵袭能力明显减弱（P<0.05）。结果表明，Src激酶抑制剂PP2能够抑制QBC939细胞中的Src激酶活性。这一结果与已有报道基本一致[15]。E-cadherin是广泛存在于组织的上皮细胞中的蛋白分子，对细胞的粘附聚集十分重要[16]。E-cadherin分子为肿瘤侵袭抑制分子，下调其表达后，肿瘤细胞的侵袭能力显著增强[17]。CD44分子则是与肿瘤预后密切相关的肿瘤促侵袭分子，当机体上调CD44的表达时，肿瘤细胞侵袭能力随即增强，肿瘤细胞更易进入血液及淋巴循环，导致肿瘤转移灶的产生[18]。本研究结果显示，Src激酶抑制剂PP2抑制Src激酶的活化后，E-cadherin分子mRNA水平和蛋白水平的表达显著增高（P<0.05），而CD44分子mRNA水平和蛋白水平的表达则明显降低（P<0.05）。结果证明，Src激酶抑制剂PP2抑制QBC939细胞中Src激酶的活化后，能上调肿瘤细胞侵袭抑制分子E-cadherin、下调肿瘤细胞促侵袭分子CD44mRNA水平，最终导致QBC939细胞侵袭能力减弱，而且5μmol/L抑制浓度为最佳。但是，PP2抑制Src激酶活化具体通过什么途径减弱肿瘤细胞的侵袭能力目前并不清楚，还需进一步研究证实。
综上所述，PP2能通过抑制Src激酶的活化显著抑制人胆管癌QBC939细胞的侵袭能力，机制可能是由于PP2抑制Src激酶活化后影响了肿瘤细胞侵袭抑制分子E-cadherin和促侵袭分子CD44的表达水平所致。这为胆管癌患者以Src激酶为治疗靶标的Src激酶特异声乐艺术论文性抑制剂美国农业论文抗肿瘤治疗策略的研发提供了实验依据。
作者：王大东 许勇 韩明明 窦春青 涂玉亮 朱自满 杨壮杰 金鑫 姜凯 杜楠 单位：解放军总医院第一附属医院
