1、MTS/CCK-8法检测细胞增殖
贴壁细胞需待细胞贴壁后，再收集各时间点细胞进行检测。收集各个时间点的细胞(0h、24h、48h、72h)加入CCK-8溶液或cellTi-ter96AQ单溶液细胞增殖检测试剂(Promega，Cat．No．G3582)，比例为1/10。即100μl培养液加入10μl检测液。在孵育4h后，酶标仪读板，MTS检测读取OD490数据，CCK-8检测读取OD450数据。流式细胞仪检测细胞周期:细胞转染后72h后每样收集1×106细胞，细胞固定，离心收集细胞，弃上清，用预冷PBS洗细胞两次，加入预冷70%乙醇，于4℃固定过夜，或-20℃长期固定。细胞染色:离心收集细胞，以1ml的PBS洗细胞一次，加入500μlPBS含50μg/ml溴化丙锭(PI)，100μg/mlRNaseA，0．2%TritonX-100，4℃避光孵育30min。流式分析:以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2～3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。
2、流式细胞仪检测细胞凋亡
细胞转染后72h后每样收集1×106细胞，细胞固定:离心收集细胞，弃上清，用预冷PBS洗细胞两次，加入预冷70%乙醇，于4℃固定过夜，或-20℃长期固定。将0．5ml细胞悬液从细胞培养板中(5×105个细胞)转移到一个干净的离心管内。加入1．25μlAnnexinV-FITC。室温(18～24°C)避光反应15min。室温1000r/min离心5min，去除上清。将细胞用0．5ml预冷的1×结合缓冲液轻轻重悬。加入10μlPropidiumIodide。将样本放置在冰上避光保存。立即用流式细胞仪检测分析。
3、Westernblotting检测
CD14蛋白表达:在细胞中加入RNA裂解液提取总蛋白，BCA法定量蛋白。将提取好样品的蛋白进行SDS-PAGE，电泳结束后电转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉溶液室温封闭1h。加入合适的一抗稀释浓度4℃温育过夜(CD14按1∶500稀释，GAPDH按1∶1000稀释)，加入1∶4000倍稀释的二抗，37℃孵育1h。温育结束后，ECL底物发光法进行曝光。洗涤PVDF膜，剥脱后加入1∶10000内参抗体，4℃温育过夜，曝光成像。Real-timePCR检测TNF-α、IL-8基因表达:收集细胞，用TRIzol法提取各细胞总RNA，采用cDNA第一链合成试剂盒反转录成cDNA。按照引物设计原则设计PCR引物，TNF-α、IL-8的上、下游引物序列如表1所示。
4、统计学分析
用SPSS11．5软件进行数据处理与分析。实验数据以x±s表示。One-wayAnalysisofVariance(One-wayANOVA)进行各组间方差分析，方差齐时用LSD法，方差不齐时用Tambane’sT2法，P＜0．05为差异有统计学意义。
5、结果
5．1感染细胞最佳MOI的测定
MTT法检测慢病毒转染SGC-7901后细胞增殖转染后24h，正常组细胞增殖率为218．18%，阴性对照组为216．27%，CD14shRNA组为211．63%，各组间相比，差异无统计学意义(P＞0．05);转染后48h、72h正常组细胞增殖率为427．49%、479．22%，阴性对照组为417．84%、473．37%，CD14shRNA组为345．54%、362．64%，经比较，CD14沉默后细胞增殖率下降(P＜0．05)。流式细胞仪检测慢病毒转染SGC-7901后细胞凋亡CD14shRNA组细胞早期凋亡、晚期凋亡及总凋亡率均高于正常组、阴性对照组，经比较，差异有统计学意义(P＜0．05，见图4)。流式细胞仪检测慢病毒转染SGC-7901后细胞周期结果显示，CD14shRNA组细胞G1期42．57%、S期38．65%、G2期13．22%;正常组细胞G1期35．91%、S期52．60%、G2期11．49%;阴性对照组细胞G1期36．78%、S期51．49%、G2期13．67%，经比较，差异有统计学意义(P＜0．05)。由此推断，CD14沉默后，主要影响细胞S期，干扰细胞合成。
5．5Westernblotting检测慢病毒载体转染
SGC-7901细胞后CD14蛋白表达Westernblotting检测结果显示，在转染胃癌细胞后，CD14shRNA慢病毒载体组细胞CD14蛋白表达相对于正常组及阴性对照组明显减少，从灰度值分析显示看出，CD14shRNA慢病毒组灰度值(0．01)远远小于正常组(1．0)及阴性对照组(0．83)，正常组及阴性对照组的灰度值基本相当，由此推断CD14shRNA慢病毒载体转染胃癌细胞SGC7901后使CD14蛋白的表达量降低，同样以WB的灰度值为纵坐标作图也反映了这样的结果(见图5)。注:RelRatio:相对比。图5CD14Westernblotting检测Fig5CD14WesternblottingdetectionReal-timePCR检测慢病毒载体转染SGC-7901细胞后TNF-α、IL-8表达结果显示，CD14shRNA转染胃癌细胞后，TNF-α、IL-8mRNA表达较正常组、阴性对照组呈下降趋势，差异有统计学意义(P＜0．05)。由此推断，CD14沉默后使TNF-α、IL-8表达下降(见表2)。
6讨论
我们研究发现CD14沉默后，胃癌细胞增殖率下降，细胞周期阻滞发生在S期，胃癌细胞合成减少，凋亡率增加，CD14/TLR-NF-κB下游炎症因子TNF-α、IL-8合成减少。综上，我们有理由推测CD14基因在胃癌的发生、发展中占据重要地位，CD14/TLR-NF-κB信号通路过度活化，导致炎症级联反应放大，阻断CD14基因表达，将对胃癌防治是有利的，下一步，我们将通过在体实验，观察沉默CD14基因后，对H英语医学论文．pyl农村农业论文ori感染结合化学诱导法所致胃癌的干预作用。
作者：方培植 陈远能 黄会云 陈思羽 郑东林 张涛 单位：广西横县中医院消化内科 广西中医药大学附属瑞康医院
