1材料与方法
1.1实验动物及材料
健康纯种新西兰大白兔16只，雌雄不限，体重2.5~3.0kg，由青岛大学附属医院动物实验中心提供并饲养。VX2鳞状细胞癌细胞系（由中国海洋大学医药学院提供）。Dextran-DTPA-Gd由青岛大学附属医院口腔颌面外科与中国海洋大学医药学院联合研制[7]，为特异性淋巴造影剂，用于淋巴管及淋巴结的显影[8]。亚甲蓝注射液（2mL∶20mg,江苏济川制药有限公司）。GEHDXSigna3.0T超导型核磁共振扫描仪（美国GE公司）。
1.2兔舌癌移植瘤模型的建立
所有动物使用氯胺酮溶液（50mg/kg）和地西泮(5mg/kg)经股四头肌注射麻醉。使用组织块植入法[9]制作兔VX2舌癌转移模型。切取荷瘤兔肿瘤边缘生长旺盛的鱼肉样组织，剔除结缔组织及坏死组织，剪成1mm3大小的组织块，置于生理盐水中备用。切开实验兔左侧舌缘中1/3，暴露舌肌，植入1～2块肿瘤组织块，缝合后纱布加压止血。2组实验兔术后送回饲养中心常规饲养，肌注青霉素40万U/只，每天1次，连续3d。
1.3Dextran-DTPA-Gd间质磁共振淋巴造影
14只接种成瘤兔于21d后行dextran-DTPA-Gd间质磁共振淋巴造影。MR平扫：3DFastTOF-SPGRCE-MRA序列扫描，Flip角30°，TE1.6ms，TR4.5ms，视野（FOV）280mm×280mm，矩阵360×224，层厚1.0mm，slah70，NEX2。增强扫描：平扫后于兔左侧舌体黏膜下注射dextran-DTPA-Gd0.2mL，右舌缘注射同剂量作为对照。按摩30s后，分别于注射造影剂后15、30、45、60min，4、24h行增强扫描，进行淋巴结及淋巴管的重建，以获得三维图像。
1.4图像采集及分析
所有原始图像应用最大信号强度投影，进行淋巴系统重建，以获得三维图像。采用兴趣区（ROI）法测量[10]，计算注射前、后淋巴结的信号强度(SI)和系统噪声（N）。利用SNR=SI/N，E%=(SNRpost-SNRpre)/SNRpre×100%计算淋巴结的信噪比（SNR）及信号强化率（E%），SNRpost、SNRpre分别代表增强扫描前、后信噪比。由2名5年以上临床经验丰富的放射科医师独立分析影像，定位SLN，对可疑转移淋巴结进行体表标记。
1.5病理学检查
所有实验兔正常饲养24h后，于注射区相同部位注射亚甲蓝活体染色，根据蓝染部位及磁共振扫描时的体表标记，解剖淋巴结，行病理学检查。
1.6统计学分析
采用SPSS19.0软件包对数据进行分析，计量资料以x±s表示，双侧颈淋巴45min时信号强化率数据行配对t检验；磁共振造影诊断结果与病理结果对照，应用McNemar的确切概率法分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。
2结果
2.1影像学检查结果
注射造影剂后颈部淋巴管及淋巴结显影，信号强度升高，左侧(肿瘤侧)在45min时达到峰值（256±32）%，对侧在30min时达到峰值（368±33）%，后逐步下降。肿瘤侧淋巴结显影强度明显低于对侧。45min时，双侧颈淋巴（2号兔除外）信号强化率数据经配对t检验，其显影强度差异具有统计学意义（P<0.05）。45min时图像显示：右侧颈淋巴管道呈串珠状，连贯且较清晰，淋巴结显影密度高且均匀，呈椭圆状，边缘整齐，考虑为正常淋巴结；左侧淋巴管道显影不清晰，有阻断，淋巴结体积增大，内部密度不均，有充盈缺损，边缘毛糙，考虑为癌转移。2号兔显影较为特殊，造影剂同时显影了双侧一、二级淋巴结，以及左侧颈部2条相对独立的淋巴管道。左侧SLN边缘毛糙，密度高，体积明显增大，形态欠规则，未见明显充盈缺损，二级淋巴结则边缘毛糙，形态不规则，密度不均且伴有明显充盈缺损。右侧SLN充盈缺损、密度不均、边缘毛糙，而二级淋巴结显影无明显异常。根据影像学表现，考虑12只兔的左颈SLN、2号兔的双侧SLN及左颈二级淋巴结均发生癌转移，整个造影过程中无伴行血管显影。
2.2亚甲蓝活体染色结果
亚甲蓝染色下，兔颈部淋巴管蓝染明显，最终亚甲蓝汇入淋巴结（图4a）。根据IMRLG提示，在仔细解剖2号兔SLN深面时，又发现1条独立的淋巴管道，该淋巴管道走行至SLN近心端约0.8cm后，直接注入二级淋巴结（图4b）。因此，根据IMRLG提供的信息，比较容易判定SLN的位置及数目。
2.3病理学检查
结果16只实验兔，14只成功建立了舌癌模型，其中12只出现淋巴转移（图5）。解剖淋巴结30枚，13枚为转移淋巴结，包括11只左颈部SLN，2号兔右颈SLN及左颈二级淋巴结。IMRLG诊断转移15枚，其中2枚经病理证实为反应性增生（2、7号兔左颈SLN，为假阳性，如表2），诊断阳性率为86.7%(13/15)。应用McNemar确切概率法计算2种方法诊断淋巴转移的准确率，其差异无显著性(P＞0.05)。
3讨论
舌癌隐匿性颈淋巴结转移率高，而cN0患者术前淋巴结状况的判断和定位直接影响临床分期及治疗方案[3]。由于舌淋巴分布丰富，前后位置不同，其引流淋巴管及SLN也不尽相同。尽管通过超声、CT、MRI等影像学检查，其颈淋巴转移的诊断水平有了很大提高，但对微小的（＜10mm）隐匿性颈淋巴结转移状况的判断，以及SLN的定位仍较困难。目前国内外诸多学者发现，使用IMRLG显像SLN具有独特优势[11]，IMRLG已用于乳腺癌、宫颈癌等SLN的研究[5]。由于临床使用的是商品化的欧乃影、马根维显等造影剂，其分子粒径过小，易快速被血管吸收，造成伴行静脉显影且强度明显高于淋巴管，因此淋巴显影差，在成像后需不断调整角度来分辨淋巴管和血管[4]。为此，我们合成了平均分子粒径130nm，相对分子质量45000Da的大分子dextran-DTPA-Gd，并于正常新西兰大白兔双侧舌缘黏膜下注射后行颈部淋巴造影，发现其具有较长的峰值平台期，能快速有效地显示正常兔颈部引流淋巴管的走行及淋巴结形态[7]。为了早期评价头颈癌颈淋巴结转移状况，以及准确定位SLN，我们建立了兔VX2舌癌转移模型，采用dextran-DTPA-Gd进行舌癌IMRLG实验。注射造影剂后，正常淋巴结30min左右显影强度达到高峰、密度均匀，边缘整齐呈椭圆状，淋巴管呈连贯清晰的串珠状。转移淋巴结45min左右信号强度达到高峰，结内密度不均，有充盈缺损，边缘毛糙，体积增大，淋巴管显示断续不清晰，提示转移淋巴结内部分组织结构被癌侵袭，形态发生改变，造成吸收吞噬能力降低。IMRLG显示的淋巴管和淋巴结与亚甲蓝活体染色的SLN的位置及数目一致，经病理证实IMRLG发现淋巴结转移的阳性确诊率为86.7%（13/15）。表明dextran-DTPA-Gd作为造影剂的IMRLG，可有效显示舌癌转移的SLN。实验2号兔左侧SLN体积增大、边界不清，病理检查为反应性增生，与IMRLG观察结果不一致。经亚甲蓝活体染色，解剖中发现左侧二级淋巴结的淋巴管并非来自哨位淋巴结的输出管，而是来自一条新的独立淋巴管道。考虑可能与以下因素有关：①头颈部器官淋巴分布丰富、淋巴管走形复杂，同一器官虽然有主要的淋巴引流通路，但同时可存在个别淋巴旁路，导致正常淋巴回流或肿瘤细胞扩散可经过几条不同的淋巴通道完成[12]。此发现可在一定程度上解释不同个体间相同口腔部位的组织可有不同区域的SLN，以及肿瘤为什么会有发生跳跃性转移可能；②SLN淋巴结、淋巴管受癌累及，引起区域淋巴液回流受阻后，颌面部为引流淋巴液，会形成新的回流淋巴管[13]，而新生淋巴管可将癌细胞直接转移至二级淋巴结；③Dextran-DTPA-Gd的IMRLG仅在1只兔上发现淋巴旁路，说明本造影剂及MR空间分辨观察上还有待进一步提高。Dextran-DTPA-Gd间质磁共振淋巴造影可有效定位兔VX2舌癌的SLN，为鉴别淋巴结是否转移提供了依据，是一种值得研究的诊断早期口腔癌颈淋巴转移的新技术。
作者：李方龙 单位：青岛大学附属医院
