1干酪中的脂解作用和参与其中的酶
食品中的脂类，尤其是多不饱和脂肪酸，可发生氧化或水解降解，形成多种不饱和醛，这些不饱和醛具有强烈的风味，产生称为氧化酸败的风味缺陷。但是，干酪中的脂类不会发生广泛的氧化作用，这可能是因为干酪中的氧化还原电位较低(－250mV)和天然抗氧剂(如VE)存在的缘故［8］。因此，在正常情况下，脂类的氧化对干酪风味的影响较小。脂类影响干酪风味的主要原因是脂类的酶促水解和脂肪酸的代谢。天然干酪中脂类对干酪的典型风味和质地发展起着重要的作用，是一些干酪品种特征风味物质的主要来源［8］。脂解作用产生的脂肪酸，尤其是中短链游离脂肪酸的释放，直接有助于干酪的特征风味［9］。不同品种干酪中的脂解作用有很大的差异。霉菌成熟干酪脂解作用较高，卡门培尔干酪(Camembertcheese)的甘油三酸酯有5%～10%发生了脂肪水解作用，丹麦蓝纹干酪(Danablucheese)中的脂解作用更高，多达18%～25%的甘油三酸酯被水解为游离脂肪酸。而意大利帕梅森干酪(Parmigiano－Ｒeg-gianocheese)和波河干奶酪(GranaPadanocheese)制作过程中因凝乳热烫温度比较高，减少了脂蛋白脂酶在干酪成熟期间的作用，其脂肪水解作用较低一些。此外，对于高达干酪(Goudacheese)、格里尔干酪(Gruyèrecheese)和切达干酪(Cheddarcheese)等来说，甘油三酸酯的水解率更低，不超过2%［3］。干酪脂解作用是由酯酶或脂肪酶作用的结果。这2种酶的差别主要在于作用的底物脂肪酸碳链的长度、底物的物理化学特性和酶反应动力学方面，酯酶水解2～8个碳原子长度的酯酰基链，脂肪酶水解10个或更多碳原子的酯酰基链;酯酶作用于水相可溶性底物，而脂肪酶作用于乳化的底物;酯酶催化作用属于典型的米凯利斯－门坦反应动力学(MichaelisMenten－typekinetics)，脂肪酶的催化作用发生在两相的界面处，遵循界面间的米凯利斯－门坦反应动力学［10］。但是在实际应用中，2个酶经常出现相互混用的情况。干酪中的脂解作用的酶来自于牛乳、凝乳酶制剂、发酵剂、附属发酵剂、非发酵剂乳酸菌和外源性酶制剂中。牛乳本身的脂肪酶是脂蛋白脂酶(Lipoproteinli-pase，LPL)，其来自于血浆中代谢血浆甘油三酸酯的LPL，牛乳中约有10～20nmol/L的脂酶。大部分LPL因高温短时的巴氏灭菌(72℃，15s)而失活，因此LPL在干酪成熟期间其作用并不大［11］。即使在生乳中，大部分LPL的活性为乳脂肪球膜或酪蛋白胶束所阻碍，一旦乳脂肪球膜被破坏便会使得LPL对乳脂肪产生过多水解，导致干酪等乳制品产生不良风味。LPL的脂解作用对生牛乳制作的干酪的风味发展起着重要的作用，而在巴氏杀菌牛乳制作的干酪中残留LPL的脂解作用对干酪风味的作用较小［11］。LPL水解作用对脂肪酸的类型没有特定的要求，但偏好水解中等长度碳链脂肪酸的甘油酯，链长C6∶0、C8∶0、C10∶0、C12∶0脂肪酸的甘油酯的水解速度比链长C16∶0、C18∶0、C18∶1、C18∶2、C18∶3或C20∶0脂肪酸甘油酯的水解速度增加了2倍［12］。LPL对脂肪酸在甘油酯的位置有特定要求，只水解甘油一酸酯、甘油二酸酯和甘油三酸酯sn－1和sn－3位置的脂肪酸［13］。商业化的凝乳酶正常情况下没有脂解能力。但是，含有脂肪分解酶前胃酯酶(Pregastricesterase，PGE)的凝乳酶浆常被用来制作波萝伏洛干酪(Pro-volonecheese)和罗马诺干酪(Ｒomanocheese)等硬质意大利干酪。
PGE尽管名称中含有酯酶，其实是脂肪酶的一种，水解非水相的甘油三酸酯，PGE对酯化在sn－3位置的短链脂肪酸具有高度的特异性［14］，但也可水解长链的脂肪酸。来源不同的PGE的脂解作用存在明显的差异，小牛、小山羊和羔羊的PGE特异性决定了一些干酪品种的风味特征。从屠宰前饲喂不同饮食的羔羊制备的凝乳酶浆制作的意大利费欧洛沙多干酪(FioreSardocheese)，在干酪成熟期间脂解作用水平和游离脂肪酸分布存在明显的差异［15］。乳酸菌具有水解甘油三酸酯、甘油二酸酯和甘油一酸酯的酯酶和脂肪酶。一般情况下，乳酸菌的脂肪水解活性与其他细菌和霉菌相比显得弱一些，许多乳酸菌菌株显示活性优势的是酯酶而不是脂肪酶。但是，由于乳酸菌在天然干酪中持续存在，其在干酪长期成熟过程中的脂解作用也是不可忽视的。乳酸菌的酯酶和脂肪酶位于细胞内，需要细胞自体溶解或以其他方式释放到菌体外才可以接触到干酪中的反应底物，以具有高度自体溶解的乳乳球菌乳脂亚种AM2(Lactococcuslactissubsp.CremorisAM2)制作的切达干酪在成熟期间比以不易自体溶解的乳乳球菌乳脂亚种HP(Lactococcuslactissubsp.cremorisHP)制得的干酪产生更多的辛酸(C8∶0)、肉豆蔻酸(C14∶0)、棕榈酸(C16∶0)和硬脂酸(C18∶0)等游离脂肪酸［16］。乳酸菌酯酶对C6以上脂肪酸的甘油二酸酯的活性较低，甘油一酸酯是其作用的首选底物，尤其是C8脂肪酸形成的甘油一酸酯。乳酸菌酯酶活性需要注意的另一个方面是其合成反应，在这里酯的合成不仅从醇和甘油三丁酸酯来合成，也可以通过乙醇和甘油酯的醇解作用来合成［3］。丙酸菌的脂解作用尤其值得一提，其活性比乳酸菌强10～100倍，通过将乳酸转变为乙酸、丙酸和二氧化碳，丙酸菌对瑞士干酪(Swischeese)特征风味的发展起着重要的作用［17］。来自细菌、酵母和霉菌的脂肪分解酶常被应用到林堡干酪(Limburgercheese)、布里干酪(Briecheese)、罗克福尔干酪(Ｒoquefortcheese)和蓝纹干酪(Bluecheese)等干酪中，脂肪分解酶的作用对这些干酪的风味特征有着重要的贡献［3］。表面涂层成熟干酪中亚麻短杆菌(Brevibacteriumlinens)的脂肪水解活性对成熟期间的脂解作用有重要的作用。Fox等从亚麻短杆菌纯化出一种胞内酯酶，该酶对短链脂肪酸酯显示出优先水解的选择性，能够从β－萘基底物中释放出乙酸、丁酸、己酸、辛酸和癸酸［3］。青霉菌(Penicilliumspp.)因具有许多脂酶，常被应用在布里干酪、卡门培尔干酪、洛克福干酪、丹麦蓝纹干酪和葛更佐拉干酪(Gorgonzolacheese)等霉菌成熟干酪中［8］，这些青霉菌包括罗克福尔青霉菌(Penicilliumroqueforti)、沙门柏干酪青霉菌(Penicilliumcamember-ti)、Penicilliumcaseiocolum、白青霉(Penicilliumcandi-dum)和灰绿青霉菌(Penicilliumglaucum)等［7］。罗克福尔青霉菌有2种脂酶，其最优pH分别为7.5～8.0和9.0～9.5;沙门柏干酪青霉菌产生的一种胞外脂酶活性的最优pH为9.0［18］。其他一些微生物也被用来从乳脂合成风味化合物，如解脂无色杆菌(Achromobacterlipolyticum)、米黑毛霉(Mucormie-hei)、溶脂念珠菌(Candidalipolytica)、白地霉(Geotri-chumcandidum)、德氏根霉(Ｒhizopusdelemar)等［7］。白地霉具有一种对双键位于cis－9或cis，cis－9，12的不饱和脂肪酸具有高度特异性的脂酶，尤其对于顺－9－十八烯酸(cis－9－octadecanoicacid)具有优先选择性，这种脂酶的最适pH为5.5～7.5，对某些表面成熟的干酪具有重要的作用［18］。汉逊德巴利酵母(Debaryomyceshansennii)、解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)和劳伦梯隐球酵母(Cryptococcuslaurentii)等的脂解作用对干酪成熟具有重要的作用，在干酪制作中常使用一种或多种酵母来释放更多的游离脂肪酸［3］。
2脂肪酸的代谢及其对风味的作用
干酪中微生物的脂解作用释放出游离脂肪酸，这些脂肪酸中的短链和中等长度碳链的脂肪酸直接有助于干酪的风味。乳脂肪水解产生的长链游离脂肪酸(＞C12∶0)对干酪风味的作用比较低，主要是因为这些脂肪酸的风味阈值比较高［19］。短链和中等长度链长(C4∶0～C12∶0)的脂肪酸的风味阈值比较低，很容易被感知而表现出明显的特征风味。丁酸呈现出“酸败的(rancid)”和“令人不愉快的(cheesy)”风味特点，己酸表现出“辛辣刺激的(pungent)”和“蓝纹干酪味的(bluecheese)”风味特点，辛酸给人一种“蜡状的(wax)”、“似肥皂的(soap)”、“山羊味的(goat)”、“发霉的(musty)”、“酸败的”和“水果味的(fruity)”的风味特征。游离脂肪酸风味的强烈程度不仅取决于其浓度，也取决于其在水相和脂相的分布情况、介质的pH值、某些阳离子(如钠离子、钙离子)的存在情况以及蛋白质降解产物的存在情况［20］。脂解作用对干酪风味更重要的作用在于脂肪酸的进一步代谢。游离脂肪酸可以作为代谢前体被代谢为甲基酮类、内酯类、酯类、烷类和二级醇类等风味化合物(如图1－B所示)。这些代谢产物对干酪的风味具有更重要的作用。甲基酮类是干酪中脂肪酸代谢产生的重要风味化合物。甲基酮的产生是霉菌脂肪酶作用的结果，如罗克福尔青霉菌、沙门柏干酪青霉菌、白地霉等，无论是霉菌的孢子还是菌丝体都能产生甲基酮类化合物［21］，甲基酮产生的速率受温度、pH、霉菌的生理状态以及游离脂肪酸浓度的影响。需要强调的一点是，甲基酮产生的前体并不仅仅是脂肪酸，酮酸在脂类浓度低的情况下和单不饱和脂肪酸都可以被霉菌用来合成甲基酮类［22］。甲基酮类的还原可以形成二级醇［19］。甲基酮通常都有很低的风味阈值，如2-庚酮在水中的风味阈值是0.0009～3.0mg/kg。2-辛酮、2-壬酮、2-癸酮、甲基正壬酮和甲基正十二烷酮具有“水果味的”、“似花香的(floral)”和“发霉的”气味特征，2-庚酮具有蓝纹干酪的特征风味［23］。甲基酮的蘑菇味和发霉的气味特征对卡门培尔干酪的风味具有重要的作用［3］。二级醇来源于脂解作用，对干酪风味的形成也有贡献。2-丙醇、2-丁醇、2-辛醇和2-壬醇在多数软质干酪中都有发现，也是蓝纹干酪风味的典型化合物成分［24］。1-辛烯-3-醇具有未加工蘑菇的气味，又被称为蘑菇醇，其风味阈值为0.01mg/kg，是卡门培尔干酪整体风味的关键成分之一［25］。酯类和硫酯类化合物也是干酪脂肪酸代谢的挥发性化合物。酯类是游离脂肪酸和醇类发生酯化反应形成的化合物，参与反应的醇类来自于乳糖和氨基酸的代谢。脂肪酸形成的甲酯、乙酯、丙酯、丁酯等在多种干酪中都已确定［3］。硫酯类是游离脂肪酸和游离的巯基反应生成的产物。微球菌(Micrococcaceae)和乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)可产生S-甲基硫酯;固定化米黑根毛霉脂肪酶(Ｒhizomucormieheilipase)可催化短链风味硫酯的合成，如硫代丙酸甲酯/乙酯、硫代丁酸甲酯/乙酯、硫代己酸甲酯/乙酯等［26］。
酯类化合物对干酪风味发展重要的原因是因为酯类通常具有较低的风味阈值。分子质量低的酯通常具有“水果味”气味。高浓度的丁酸乙酯使得格里尔干酪和帕尔马干酪(Parmesancheese)具有水果味特征［24］。而在切达干酪，水果特征的风味被认为是一种风味缺陷［8］。硫酯经常是一些食品的特征风味，如洋葱、大蒜和某些水果。切达干酪挥发性风味活性成分的顶空分析发现，分离出的大部分酯具有“黄油样的(buttery)”到“水果味的”的气味，而硫酯具有“令人不愉快的(cheesy)”气味［27］。内酯是羟基酸分子内酯化的结果。α-和β-内酯高度活泼，不能稳定存在，但γ-和δ-内酯比较稳定，已在多种干酪中发现。除了羟基酸，一些代谢途径也可以利用非羟基酸代谢产生内酯，如罗克福尔青霉菌孢子及其营养菌丝体利用长链的脂肪酸(C18∶1和C18∶2)生成内酯(C12∶0)［28］内酯类化合物往往具有强烈的风味，它们不仅对干酪的整体风味的发展具有重要的作用，而且有助于使干酪具有黄油样丝滑的感觉。δ-内酯具有比较低的阈值，并通常被描述为“桃味的(peach)”、“杏味的(apricot)”和“椰子味的(coconut)”等显著的水果类的风味特征。γ-内酯比δ-内酯的阈值还要低，γ-辛内酯、γ-癸内酯和γ-十二内酯在水中的阈值为7～11μg/Kg。γ-C12、γ-C14、γ-C16、δ-C10、δ-C12、δ-C14、δ-C15、δ-C16和δ-C18内酯都已在切达干酪中鉴定出来［3］。此外，一些直链醛也可以由不饱和脂肪酸的β-氧化而形成，如丁醛、庚醛、壬醛等，这些醛类常常表现出“类似青草的(greengrass-like)”的风味［3，19］。为了缩短干酪成熟时间和确保始终如一的高质量的风味特征，促进干酪风味的形成和改进方法成为研究者长期关注的研究目标。这类研究多数集中于通过乳酸菌和酶技术来提高蛋白质的水解作用，但仍有大量的努力通过外源性的脂肪酶制剂的脂解作用来加快干酪的成熟并取得成功。添加了脂肪酶的蓝纹干酪、埃及拉斯干酪(Ｒascheese)和多米艾提干酪(Domiaticheese)、意大利的罗马诺干酪和芳缇娜干酪(Fontinacheese)的脂解作用提高，并在一定程度上增强了它们的感官特性［1］。在添加了羔羊PGE和真菌脂肪酶的伊迪阿扎巴尔干酪(Idiazabalcheese)中其游离脂肪酸分别提高了70%和30%，在感官评价中添加PGE的干酪的风味得分最高［29］。
3展望
脂解作用对干酪风味发展的影响逐渐得到重视。脂蛋白脂酶和前胃酯酶对干酪风味的作用尽管没有微生物酯酶和脂肪酶大，但其作用也是不可忽视的。这些酶的作用和进一步代谢产生的化合物对干酪风味的作用仍没有完全研究清楚。为了更好地发挥这些酶的潜力，需要对这些酶在干酪基质中的活性机制进行更深入的研究。在乳酸菌研究方面，需要阐明的关键问题之一是菌体自体溶解和细胞通透性释放的胞内酶的量化和影响，以及对这些酶在干酪特定的理化环境中的稳定性的量化。为了增强干酪的风味，需要通过发酵剂技术和酶技术筛选或生物技术改造乳酸菌，使得这些乳酸菌具有类似前胃酯酶或脂蛋白酯酶的作用。发酵剂和附属发酵剂都可以通过氨基酸产生脂肪酸，氨基酸代谢与脂解作用的相互作用也需要进一步研究。此外，在通过提高脂解作用改善干酪风味的过程中也必须考虑干酪成熟过程中氨基酸代谢的作用。
作者：建平 刘振民 杭峰 于华宁 郭本恒 李云飞 单位：光明乳业股份有限公司乳业与生物技术国家重点实验室 上海交通大学农业与生物学院食品科学与工程系
