1、RT-PCR检测DCNmRNA表达
细胞分组及处理同，用Trizol提取细胞总RNA，cDNA合成体系20μl，小鼠白血病病毒(M-MLV)逆转录酶200U，二硫苏糖醇(DTT)0.2μmol/L，RNA酶抑制剂(RNase抑制剂，RNasin)20U，四种脱氧核苷酸混合物(dNTP)20nmol/L，随机引物100ng，RNA模板1μg，25℃10min，42℃60min，95℃1min灭活逆转录酶，冰浴1min。PCR反应引物为，DCN上游引物:5'ACCGAAATCAAAGATGGAGACT3'下游引物:5'ATCAGCAATGCGGATGTAGGAG3'扩增产物为348bp，反应体系25μl，94℃预变性5min，94℃变性30s，49℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环，最后72℃5min结束反应。β-actin上游引物:5，ACGGATTTGGTCGTATTGGG3，下游引物为:5，TGATTTTGGAGGGATCTCGC3，扩增产物为230bp。取10μl扩增产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴乙啶染色，紫外灯下观察并照相，凝胶图像分析仪分析，根据DCN与β-actin灰度比值，进行目的基因表达的半定量分析。
2、结果
2.1两株子宫内膜癌细胞内PCNA的表达
显微镜下可见，PCNA阴性细胞核无着色，胞质呈淡黄色。阳性细胞整个核内分布着大小均匀的浅黄色、黄色或棕黄色细小颗粒。细胞计数结果显示，未经处理的两株子宫内膜癌细胞内PCNA阳性细胞数目相当，经RG和RA两种信号通路抑制剂作用后，Ishikawa细胞变化明显，PCNA阳性率明显低于相同处理的HEC-1A细胞组(P=0.022、0.043)，二药合用后两株细胞PCNA阳性率差异更为显著(P=0.007)。在Ishikawa细胞内，与未加药的空白组比较，两种抑制剂单用均可降低PCNA阳性表达率(P=0.036、0.027)，合用效果更为显著(P=0.001)，而在HEC-1A细胞内，无论抑制剂单独或合用PCNA阳性率与空白组比较变化均不大，作用效果不明显(P=0.061、0.064和0.059)，见表1。
2.2抑制剂对两株细胞DCN蛋白表达的影响
从图1中可见，两株子宫内膜癌细胞中均存在DCN蛋白的表达，经10μmol/LRG及10μmol/LRG联合10μmol/LRA作用24h后，Ishikawa细胞内DCN蛋白表达量呈不同程度的增多，尤其以两种抑制剂合用增加效果更为显著。定量分析结果显示，未经处理的Ishikawa细胞内DCN的灰度值为0.191±0.0258，经RG及RG联合RA作用后，灰度值则分别上升至0.288±0.0899(P=0.031)和0.437±0.0165(P=0.002)。相比之下，HEC-1A细胞内DCN蛋白的表达量则受抑制剂影响较小，A、B、C组DCN蛋白灰度值分别为0.494±0.0216、0.477±0.0159和0.459±0.0821(P=0.072和0.068)。
2.3抑制剂对两株细胞DCNmRNA表达的影响
从图2中可见，两株子宫内膜癌细胞内均有DCNmRNA的表达，10μmol/LRG及10μmol/LRG联合10μmol/LRA作用24h均可明显上调Ishikawa细胞内DCNmRNA的表达水平，尤其以二药合用效果更为显著。半定量分析结果显示，A组Ishikawa细胞内DCNmRNA的比值为0.258±0.0334，经RG及RG联合RA作用24h后，比值分别上升至0.595±0.0642(P=0.017)和0.858±0.0706(P=0.01)。而HEC-1A细胞内DCNmRNA的表达则受抑制剂作用影响较小，对照组及RG或RG联合RA组内DCNmRNA的灰度比值分别为0.775±0.0173、0.751±0.0353和0.777±0.0324(P=0.064，P=0.057)。
3、讨论
本研究发现PTEN基因表达缺失的Ishikawa细胞对抑制剂作用敏感，无论RG、RA单独或联用均能降低细胞内PCNA阳性表达率，联用效果更为明显。而PTEN基因表达完整的HEC-1A细胞则对抑制剂作用不敏感。由于PCNA是一种主要表达在细胞增殖周期S期的核内蛋白，其作为DNA复制时δ聚合酶的辅助物，可直接参与核内DNA的合成，与细胞增殖有明显关系，故被认为是另一种可准确反映细胞增殖状态的评判指标〔8〕，PCNA检测结果说明，EGFR和mTOR信号通路抑制剂均可明显抑制Ishikawa细胞增殖，而对HEC-1A细胞生长影响不大，与本研究前期采用MTT法和流式细胞法检测结果一致〔9，10〕。DCN是一种富含亮氨酸的蛋白聚糖，被认为是一种肿瘤生长的负性调节因子〔11〕，有研究表明，DCN的表达与肿瘤的恶性程度呈负相关，即DCN的表达越高，肿瘤的恶性程度越低，反之，DCN的表达越低，肿瘤的恶性程度则越高〔12，13〕。本实验显示在Ishikawa细胞内，EGFR和mTOR信号通路抑制剂单独或联用均可明显上调DCN基因和蛋白的表达水平，而在HEC-1A细胞内DCN的基因和蛋白表达则不受影响。两株子宫内膜癌细胞对相关信号通路抑制剂存在不同的敏感性推测主要与PTEN基因有关〔14〕，PTEN基因作为抑癌基因，其表达的PTEN蛋白可通过双重磷酸酯酶活性负性调控PI3K/AKT/mTOR、FAK及MAPK途径进而对细胞增殖、凋亡、迁移等产生影响。Ishikawa细胞内由于缺乏PTEN蛋白，使得原癌基因ErbB1(HER1)的表达产物EGFR及其下游PI3K/AKT/mTOR通路呈一种慢性激活状态，故而对抑制剂作用敏感。此外，有研究报道，DCN的抗肿瘤作用与其能抑制EGFR的酪氨酸激酶活性，减弱EGFR介导的胞内钙动员及激活细胞凋亡蛋白激酶促发细胞凋亡有关〔15，16〕。本实验中，EGFR和mTOR信号通路抑制剂能在基因和蛋白水平上明显上调Ish-ikawa细胞内DCN的表达，而增多的DCN蛋白反过来又可通过抑制EGFR的酪氨酸激酶活性进而进一步增强其对细胞增殖的抑制作用，这可能也是Ishikawa细胞对信号通路抑制剂作用敏感的另一原因。
作者：邓守恒 李林均 曹风军 蔡晓军 孟燕 陈萍 单位：湖北医药学院附属人民医院肿瘤中心
相关专题：微生物学杂志影响因子 辽宁行政学院学报
