一、方法
1．细胞培养:HT-29细胞以含1%青霉素-链霉素混合液、10%胎牛血清的McCoy’s5A培养基培养于5%CO2、37℃饱和湿度的细胞培养箱中，常规消化传代，取对数生长期细胞进行实验。2．CCK-8法检测细胞增殖情况:取对数生长期细胞制成单细胞悬液，以1×104/孔接种于96孔板，于培养箱内孵育24h后，分别加入终浓度为0、10、20、30、40mmol/L的5-ASA溶液，每组设5个复孔，避光孵育24h后弃培养基，加入含10μg/LCCK-8的培养基避光孵育1．5h。以酶标仪测定450nm波长处各孔吸光度(A)值，计算细胞增殖抑制率，细胞增殖抑制率=［1－(对照组A值－处理组A值)/(对照组A值－本底A值)］×100%。3．TUNEL法检测细胞凋亡情况:取对数生长期细胞，以1×105/皿接种于直径3cm的培养皿，孵育24h后，分别加入终浓度为0、10、20、30、40mmol/L的5-ASA溶液，避光孵育24h后加入4%多聚甲醛溶液固定60min，3%H2O2甲醇溶液阻断10min，0．5%TritonX-100溶液通透15min，滴加TUNEL工作液孵育80min，二抗孵育30min，DAB显色，苏木精复染。阳性细胞为细胞核呈棕黑色颗粒的皱缩细胞，光学显微镜下随机选取3个视野(×400)计数阳性细胞，计算凋亡指数(apoptosisindex，AI)，AI=(阳性细胞数/总细胞数)×100%。4．流式细胞术检测细胞周期:取对数生长期细胞，以8×105/孔接种于6孔板，孵育24h后，换用含3%胎牛血清的培养基培养24h(血清饥饿法)以调整细胞周期，分别加入终浓度为0、10、20、30、40mmol/L的5-ASA溶液，避光孵育24h后消化为单细胞悬液，加入A液固定10min后加入B液(ＲNaseA酶溶液)处理10min，最后加入C液(PI)染色30min后上机检测。5．免疫组化法检测AuroraB、BubＲ1蛋白表达:取对数生长期细胞，以1×105/皿接种于直径3cm的培养皿，孵育24h后，分别加入终浓度为0、10、20、30、40mmol/L的5-ASA溶液，避光孵育24h后加入4%多聚甲醛溶液固定60min，3%H2O2甲醇溶液阻断10min，0．5%TritonX-100溶液通透(AuroraB，20min;BubＲ1，10min)，山羊血清封闭25min，加入AuroraB兔抗人多克隆抗体(1∶200)孵育90min、BubＲ1兔抗人多克隆抗体(1∶300)孵育60min，二抗孵育，DAB显色，苏木精复染。光学显微镜下随机选取3个视野(×200)，测定各组平均光密度(MOD)值。
二、统计学分析
应用SPSS11．5统计软件，实验数据以x珋±s表示，多组间均数的比较采用单因素方差分析(方差齐)或Kruskal-WallisH检验(方差不齐)，组间两两比较采用LSD法(方差齐)或Nemenyi法(方差不齐)。相关性的分析采用Pearson相关分析(正态分布)或Spearman秩相关(非正态分布)。P＜0．05为差异有统计学意义。结果一、5-ASA对HT-29细胞增殖的影响CCK-8法检测结果显示，5-ASA10、20、30、40mmol/L组HT-29细胞增殖抑制率分别为(8．20±3．03)%、(14．03±2．41)%、(21．05±3．33)%和(25．59±3．90)%，随5-ASA浓度升高而升高，各组间差异均有统计学意义(P＜0．05)。二、5-ASA对HT-29细胞凋亡的影响TUNEL法检测结果显示，5-ASA0、10、20、30、40mmol/L组HT-29细胞的AI分别为(0．27±0．38)%、(7．11±1．65)%、(7．87±1．28)%、(10．63±2．31)%和(14．82±2．93)%，随5-ASA浓度升高而升高，除10mmol/L组与20mmol/L组间外，各组间差异均有统计学意义(P＜0．05)(图1)。
三、5-ASA对HT-29细胞周期的影响
流式细胞检测显示，5-ASA0、10、20mmol/L组间HT-29细胞G0/G1期细胞比例无明显差异(P＞0．05)，30、40mmol/L组G0/G1期细胞比例显著低于0、10、20mmol/L组，且40mmol/L组显著低于30mmol/L组(P＜0．05)(表1)，提示10～20mmol/L5-ASA对G0/G1期细胞比例无明显影响，而30～40mmol/L5-ASA可使G0/G1期细胞比例显著减少。5-ASA0、10、20、30mmol/L组间S期细胞比例无明显差异(P＞0．05)，但四组S期细胞比例均显著低于40mmol/L组(P＜0．05)(表1)，提示10～30mmol/L5-ASA对S期细胞比例无明显影响，而40mmol/L5-ASA可使S期细胞比例显著增加。5-ASA0、10、20mmol/L组间G2/M期细胞比例无明显差异(P＞0．05)，30、40mmol/L组G2/M期细胞比例显著高于0、10、20mmol/L组，且40mmol/L组显著高于30mmol/L组(P＜0．05)(表1)，提示10～20mmol/L5-ASA对G2/M期细胞比例无明显影响，而30～40mmol/L5-ASA可使G2/M期细胞比例显著增加。
四、5-ASA对HT-29细胞AuroraB表达的影响
免疫组化法检测结果显示，AuroraB阳性染色主要表达于细胞核，呈深棕色颗粒，细胞质和细胞膜则均无表达。5-ASA0、10、20、30、40mmol/L组AuroraBMOD值分别为0．78±0．03、0．55±0．03、0．53±0．04、0．47±0．03和0．36±0．02，随5-ASA浓度升高而降低，除10mmol/L组与20mmol/L组间外，各组间差异均有统计学意义(P＜0．05)(图2)。
五、5-ASA对HT-29细胞BubＲ1表达的影响
免疫组化法检测结果显示，BubＲ1阳性染色主要表达于细胞质，呈棕黄色颗粒，细胞核中有少量表达。5-ASA0、10、20、30、40mmol/L组BubＲ1MOD值分别为0．31±0．01、0．26±0．02、0．26±0．01、0．24±0．02和0．22±0．01，随5-ASA浓度升高而降低，10、20、30、40mmol/L组间差异无统计学意义(P＞0．05)，但均显著低于0mmol/L组(P＜0．05)(图3)。
六、5-ASA浓度与HT-29细胞增殖、凋亡以及AuroraB和BubＲ1蛋白表达的关系
Spearman相关分析显示，5-ASA浓度与HT-29细胞增殖抑制率(rs=0．91，P=0．00)、凋亡率(rs=0．89，P=0．00)呈正相关，与AuroraBMOD值(rs=－0．96，P=0．00)、BubＲ1MOD值(rs=－0．86，P=0．00)呈负相关。七、AuroraB、BubＲ1蛋白表达与HT-29细胞增殖、凋亡以及细胞周期的关系Pearson相关分析显示，AuroraB、BubＲ1MOD值与HT-29细胞增殖抑制率(r=－0．81，P=0．00;r=－0．70，P=0．00)、凋亡率(r=－0．93，P=0．00;r=－0．89，P=0．00)、G2/M期细胞比例(r=－0．76，P=0．00;r=－0．73，P=0．00)呈负相关，与G0/G1期细胞比例(r=0．75，P=0．00;r=0．74，P=0．00)呈正相关。AuroraB与BubＲ1MOD值呈正相关(r=0．894，P=0．00)。
七、讨论
5-ASA应用于炎症性肠病(IBD)的治疗至今已30余年，其不仅能有效控制结肠黏膜炎症，还能通过调控COX-2/PGE2、EGFＲ、NF-κB、Wnt/β-catenin信号通路、调节细胞周期相关蛋白表达、提高细胞复制的保真度等途径实现对UC癌变的化学预防效应［3］。5-ASA是治疗UC的基础药物，有口服和灌肠两种剂型，二者在临床上多联合应用。治疗UC时，5-ASA剂量为2～4g/d，当5-ASA剂量＞1．2g/d时，可使UcCＲC发生率降低［4］。5-ASA的结肠黏膜内浓度为其有效治疗浓度，而结肠腔内药物浓度可间接反映黏膜内浓度。每日服用2g5-ASA的UC缓解期患者，结肠腔内5-ASA浓度约为20mmol/L［5］，其肠腔内浓度除与口服剂量有关外，尚与剂型相关。故本研究选择0、10、20、30、40mmol/L5-ASA，模拟UC患者口服5-ASA后的结肠腔内药物浓度，探讨该浓度5-ASA作用下人结肠癌细胞株HT-29的增殖、凋亡情况、细胞周期以及丝/苏氨酸蛋白激酶AuroraB、有丝分裂检查点蛋白BubＲ1的表达情况。本研究结果显示，5-ASA在0～40mmol/L范围内可浓度依赖性地抑制HT-29细胞增殖、促进细胞凋亡，推测可能与5-ASA通过增强磷酸化表皮生长因子受体靶磷酸酶(SH-PTP2)活性以介导EGFＲ脱磷酸化、阻断EGFＲ信号通路、激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAＲγ)、引起有丝分裂阻滞、诱导caspase依赖性细胞凋亡等因素有关［6-8］。目前，研究对5-ASA引起细胞周期阻滞的阶段尚存在争议。Ｒeinacher-Schick等［8］的研究显示，5-ASA能浓度依赖性地调节细胞周期，使细胞周期阻滞于G2/M期。然而Stolfi等［9］的研究显示，5-ASA通过降低细胞周期蛋白CDC25A表达抑制结直肠癌细胞由S期向G2期转换，导致S期细胞积聚。本研究结果显示，HT-29细胞经较高浓度(≥30mmol/L)5-ASA作用后，G0/G1期细胞数量减少、S期和G2/M期细胞数量增加，即出现S期和G2/M期阻滞，提示G1/S期转换受阻、有丝分裂检查点等细胞周期卡点跨越异常;经10～20mmol/L5-ASA作用的HT-29细胞S期和G2/M期阻滞效应不明显，提示低浓度5-ASA对HT-29细胞的细胞周期几乎无影响，其对细胞增殖的抑制和促凋亡作用可能系通过COX-2/PGE2通路等其他途径完成。然而，本研究中5-ASA的作用时间仅为24h，因此不排除低浓度长时间作用下细胞周期可进一步发生改变，后期需研究药物浓度、作用时间双重因素对HT-29细胞周期的影响。AuroraB基因位于染色体17p13，其编码产物AuroraB蛋白主要表达于细胞核，具有丝/苏氨酸激酶活性，与着丝粒中心蛋白(INCENP)、borealin、survivin构成染色体载体复合物，参与染色体-微管连接、微管张力感知、姐妹染色体分离以及细胞质分裂等事件［10］。AuroraB的表达具有时间性和空间性，其出现于细胞周期S期，在有丝分裂中-晚期转换前存在于姐妹染色体着丝粒上，在有丝分裂晚期和末期存在于纺锤体中央区［11］。Nguyen等［12］的研究发现，上皮细胞中AuroraB高表达可促进四倍体产生增多，诱导上皮细胞肿瘤形成。Tuncel等［13］的研究显示，结直肠癌组织中AuroraB表达升高，其表达水平与淋巴结转移相关。Azzariti等［14］的研究显示，AuroraB抑制剂可使结肠癌细胞染色体数目明显增加，改变细胞周期，诱导细胞凋亡，具有抗肿瘤效应。本研究结果显示，HT-29细胞的AuroraB蛋白表达水平呈5-ASA浓度依赖性降低，尤以30、40mmol/L5-ASA组为著，伴5-ASA浓度依赖性细胞增殖抑制、凋亡增加和G2/M期细胞周期阻滞，提示较高浓度的5-ASA可通过某种途径降低AuroraB表达，干扰有丝分裂，从而发挥抗癌效应。5-ASA预防UcCＲC的进程中是否存在类似效应，有待进一步研究。BubＲ1蛋白由有丝分裂检查点Mad基因家族Bub1b基因编码，位于染色体15q14～21，由23个外显子组成，启动子区有众多转录因子结合位点。BubＲ1在正常结肠上皮中仅表达于细胞质，但在结肠腺癌细胞中，除表达于细胞质外，在细胞核中亦有所表达，参与形成微管-着丝粒连接、与Bub1、Bub3、Mad2等蛋白形成有丝分裂检查点复合物、与p53相互作用参与修复细胞纺锤体损伤［15-16］。Wei等［17］的研究发现，BubＲ1表达缺失可加速胚胎细胞有丝分裂中晚期转换，使异倍体增加。Ｒao等［18］的研究显示，BubＲ1表达缺失可促进结肠肿瘤发生。然而本研究中，HT-29细胞经不同浓度5-ASA作用后，BubＲ1表达呈浓度依赖性降低，伴HT-29细胞增殖抑制、凋亡增加和G2/M期细胞周期阻滞。在人肿瘤细胞中，与其他有丝分裂检查点蛋白一样，BubＲ1出现基因突变的概率非常小，Tighe等［19］的研究显示异倍体结肠癌细胞的有丝分裂检查点无异常改变。等［20］认为，BubＲ1等组成的有丝分裂检查点异常改变并非细胞癌变的起始因素，而是通过促进原癌基因和抑癌基因突变引起细胞癌变。本研究中，HT-29细胞经5-ASA作用后阻滞于G2/M期，说明有丝分裂检查点功能正常，BubＲ1表达降低并未弱化有丝分裂检查点功能。本研究结果显示HT-29细胞的BubＲ1与AuroraB表达水平呈正相关，考虑与BubＲ1、Mad2、Bub1、Cenp-E等有丝分裂检查点蛋白募集至着丝粒需AuroraB活化有关，提示经5-ASA作用后，HT-29细胞AuroraB表达降低，导致其对BubＲ1的活化、募集减少。此外，BubＲ1启动子区含有Sp1、Nkx-2、CdxA、SＲY、MyoD、Ik-2、HNF-3b、Staf、Oct-1、Nkx-2、v-Myb、AML-1a等诸多转录因子结合位点，故不排除其他通路参与5-ASA对BubＲ1的表达抑制。综上所述，本研究结果显示，在一定浓度范围内，5-ASA可以浓度依赖性的方式降低HT-29细胞的AuroraB和BubＲ1表达，伴G0/G1期细胞数量减少、G2/M期细胞数量增加、细胞增殖抑制、凋亡增加。由此可见，5-ASA可抑制HT-29细胞增殖并诱导凋亡，其机制可能与5-ASA抑制AuroraB、BubＲ1表达，职称论文发表继而影响细胞周期有关，这可能是5-ASA抑制UcCＲC发生的作用机制之一。
作者：邓勇彬 王承党 单位：福建医科大学附属第一医院消化科 福建医科大学消化系病研究室
