血管生成是从已有的血管中以出芽的方式形成新生血管的过程。血管生成在人体许多生理和病理过程中都发挥着重要的作用,包括月经周期、胚胎发育、伤口愈合等生理过程及肿瘤发生、慢性炎症等许多病理性过程。血管生成的机制极其复杂,受到许多促血管生成因子与血管生成抑制因子的共同调节,它们之间的动态平衡对于血管的生长和稳定具有十分重要的意义。同样,为了获得足够的营养物质及释放代谢产物,卵泡的生长和发育也离不开卵泡膜血管网的构建。各种血管生成调控因子在卵泡液及卵巢组织中的表达不仅可促进卵泡膜血管的生成,还能通过其特殊的信号转导途径直接或间接促进卵子成熟、改善胚胎后续发育能力。
1、血管内皮生长因子(vascularendothelialcellgrowthfactor,VEGF)
VEGF为血管内皮细胞增殖的分裂原,是一种肝素结合双链糖蛋白,是目前已知最强的血管生成刺激因子。VEGF家族具有众多成员,包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D及胎盘生长因子。VEGF家族众多成员中,VEGF-A在血管生成中的作用最重要,是血管生成过程的主要介导者。许多研究已证实,VEGF存在于人卵泡液中,且与卵泡液的聚集及卵泡膜血管生成密切相关,是介导卵巢功能的重要信号分子。女性自然周期和促排卵周期中,在促性腺激素的作用下,卵巢局部可产生VEGF,且卵泡液中VEGF浓度明显高于血清VEGF。血清及卵泡液中VEGF表达增高的意义在于通过诱导卵泡周围微毛细血管生成,使卵泡有更多机会得到血液中FSH和LH,刺激卵泡的发育和成熟。同时,在VEGF的刺激下,卵泡壁可形成丰富毛细血管网,有利于卵泡从血液中吸收大量的必需营养物质促进自身生长。研究表明,从窦性卵泡到成熟卵泡的颗粒细胞、从中等大小卵泡到排卵前卵泡的卵泡膜细胞上,VEGF表达强度随着卵泡发育而增强。因此,排卵前VEGF升高可能间接地反应了颗粒细胞和卵泡膜细胞的增殖和成熟,是反映颗粒细胞和卵泡膜细胞分化成熟的重要生物学指标。通过研究VEGF与女性生殖的关系,发现发育中的卵泡颗粒细胞可合成VEGF并以旁分泌的方式释放到卵泡液中,诱导卵泡周围血管的生长。卵泡液VEGF水平与卵母细胞的成熟有关,卵母细胞成熟率随着VEGF水平的升高而升高。当卵泡液VEGF水平保持在一定范围内时,卵母细胞具有较高的受精率、卵裂率及妊娠率。当卵泡液VEGF水平较低时,卵泡膜血管生成减少,血管通透性下降,卵母细胞内功能完善的线粒体数减少,卵母细胞ATP含量下降,从而使卵子成熟过程中的各种生物学过程效率降低,影响卵母细胞质量及其后续发育能力。文献报道,VEGF在卵泡液的作用主要表现为,在卵泡期受HCG的调节,增加卵泡膜及卵泡壁血管内皮细胞的通透性,促进卵泡液的聚集,为卵泡液各种细胞因子前体物质的运输和激素的合成提供条件,同时在黄体形成时促进毛细血管网的构建。
2、血管生成素(Angiopoietin,Ang)
Ang是一种具有4个成员的促血管生成因子,分别为Ang-1、Ang-2、Ang-3和Ang-4。学术界对Ang-1、Ang-2的研究较多,Ang-1可与内皮细胞所表达的酪氨酸激酶受体Tie-2结合,从而促进新生血管生成及稳定;而Ang-2虽也能与Tie-2结合,但却不能诱导Tie-2受体的磷酸化,而是竞争性地引起Ang-1与Tie-2的结合减少,使血管通透性增加及稳定性下降,为Ang-1的天然拮抗剂。Ang-2可与VEGF发挥协同作用,抑制血管重构过程中Ang-1所导致的过度分支。当有VEGF-A存在时,Ang-2可促进生长因子向血管内皮细胞靠近,有利于血管生成;当无VEGF-A存在时,可促进内皮细胞凋亡,使血管退化。有关人卵泡液Ang-1及Ang-2的表达尚不清楚。但有部分早期研究表明,在早期卵泡发育过程中,Ang-1表达相对VEGF和Ang-2较丰富;晚期排卵前卵泡VEGF和Ang-2明显上调且持续表达,从而促进了卵泡血管的生成和稳定。而在非优势卵泡中,Ang-2持续表达且处于主导地位而VEGF表达缺失,从而使卵泡血管退化,抑制卵泡进一步发育。动物实验表明,Ang-2在大鼠的闭锁卵泡中表达十分丰富;Ang-1和Ang-2也表达在大鼠的各级卵泡膜细胞中,且在成熟卵泡中的表达量显著高于次级卵泡,而在小猿的囊状卵泡膜中Ang-2并不表达。羊卵巢中,Ang-2表达于颗粒细胞及各级卵泡细胞膜上,且在卵泡细胞上的表达明显高于颗粒细胞。在牛各级卵泡和闭锁卵泡细胞中均检测到血管生成素及其受体,但在成熟卵泡中的表达量最低。进一步研究发现,在牛卵泡中注射Ang-2可使孕酮升高,而注射Ang-1后同时还可使雌激素水平上升。在牛的整个排卵过程中均有血管生成素及其受体的表达,其中Ang-1在排卵期表达升高而Ang-2的表达明显下降。这与大鼠排卵期血管生成素的表达正好相反,大鼠排卵期Ang-2的表达会明显升高。另有研究发现,在大鼠排卵前给予外源性Ang-2时可干扰正常的排卵过程,阻止排卵。由此推断,血管生成素可能通过调节卵泡血管生成及与卵泡细胞和颗粒细胞膜受体结合影响哺乳动物卵泡的发育,但具有种属差异,很难直接推断其在人类生殖过程中对卵泡发育的影响。
3、基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs)
MMPs是一类能水解血管基底膜和细胞外基质,从而间接促进血管生成过程的蛋白水解酶家族。MMPs可在血管生成过程中间接帮助血管内皮细胞向血管出芽部位迁移,为血管新生提供足够的空间。MMPs家族有众多成员且在体内作用各不相同,其中与其蛋白水解活性关系最为密切的是MMP-2和MMP-9。研究表明,MMP-2通常在初级滤泡、窦前卵泡、小窦状卵泡及排卵前卵泡中的颗粒细胞表达,而MMP-9则在发育良好的窦前卵泡、窦状卵泡及排卵前卵泡膜细胞表达,提示MMP-2和MMP-9参与整个卵泡的生长发育和排卵过程。在人类正常卵泡发育过程中,卵泡在发生排卵前的两个星期内约发生400次扩张,这就需卵泡基底膜及细胞外基质同时发生相应的重塑。而卵泡液MMP-2和MMP-9可水解卵泡壁血管外基质,促进血管内皮细胞迁移而加速血管生成,从而为卵泡的发育提供丰富的血液供应。同时也通过水解细胞外基质为卵泡壁的不断扩张创造了有利条件。有研究发现,MMP-2表达于正常卵泡液中且具有明胶酶活性,而在PCOS患者卵泡液中,其性质表现更活跃。此外,MMP-2同时在人类黄体生成过程中扮演着重要的角色。通过动物实验发现,除MMP-2和MMP-9外,MMP-14在卵泡生长发育过程中具有十分重要的作用。但由于研究所需的组织很难获得,对MMP-14在人类卵泡生长发育过程中的准确作用及在卵巢组织中的定量表达仍很难得到证实。同时也很难做到对发育中的卵泡和排卵时的卵泡中两者的表达进行比较。研究发现,MMP-14和MMP-2均参与卵泡生长发育和卵泡液的形成过程。由此可见,基质金属蛋白酶是人类卵泡发育成熟的重要调控分子,有必要对其在卵泡不同发育阶段的表达进行进一步定性和定量研究。
4、活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)
ROS是细胞内氧代谢所产生的正常物质,如超氧阴离子、羟自由基、过氧化氢等。高水平ROS具有细胞毒性作用,并可诱导细胞凋亡,参与机体多种疾病的发生。但低水平的ROS作为信号转导分子,可介导内皮细胞的增殖和迁移而刺激新生血管生成。ROS源自线粒体电子传递系统、细胞色素p450、黄嘌呤氧化酶、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶、一氧化氮合酶(NOS)等,其中NADPH氧化酶是细胞内ROS的重要来源。NADPH氧化酶抑制剂DPI可通过抑制由生长因子(如VEGF、FGF等)诱导的内皮细胞的增殖和迁移,提示NADPH氧化酶产生的ROS可促进内皮细胞发生增殖和迁移,是其发挥生物学效应的必需信号分子[16]。卵泡液中ROS主要来自于颗粒细胞,在卵泡的发育过程中,随着卵泡的不断生长,卵泡内氧含量逐渐降低而O2-逐渐增加,卵泡液ROS的增多并不影响颗粒细胞的增殖,反而卵泡内的缺氧环境和ROS的表达可能在颗粒细胞和卵泡壁血管生成中起重要作用。研究表明,卵泡液ROS在一定浓度下对卵母细胞的基因表达起着重要的信号转导作用,当ROS与未拆除颗粒细胞的卵母细胞共培养时,仅出现一定程度的卵母细胞成熟率降低,并无核的损伤表现,而当ROS与拆除颗粒细胞的裸卵共培养时,卵母细胞DNA碎片及caspase-3活性显著升高,发育能力大大降低。同时研究发现,未拆除颗粒细胞的卵子内谷胱甘肽含量明显高于拆除颗粒细胞后裸卵中的表达量,这表明颗粒细胞是ROS作用于卵母细胞的主要屏障,可防止卵泡液中过多的ROS对卵母细胞的毒性作用,其机制可能与影响卵母细胞内钙离子的储存结构、干扰钙离子的动态平衡以及引起卵母细胞减数分裂停滞和降解有关。因此,卵泡液ROS的表达在卵泡过程中具有双重影响,一方面ROS可诱导卵泡膜血管的重新构建,丰富卵泡的血液供应,促进卵泡的发育;同时高浓度ROS也会通过相应的信号转导途径,对卵子的成熟和后续的发育潜能带来不利影响。
5、一氧化氮(nitricoxide,NO)
NO能刺激新生血管生成、影响血管通透性,为内皮依赖性的血管活性物质,同时可参与机体一系列生理和病理过程的调节,是一种重要的信使分子。NO通过松弛平滑肌,扩张血管,调节周围血流阻力,以及同VEGF和一氧化氮合酶(ni-tricoxidesynthase,NOS)等细胞因子一起参与机体的血管生成及其调节过程。而NO在卵泡生长发育和卵母细胞成熟等女性生殖过程中的作用与其本身的促血管生成活性并不一致。研究发现,体外NO抑制系统可抑制卵巢排卵过程,当在卵母细胞体外成熟培养基中添加NO抑制剂后,能明显阻滞卵母细胞的成熟过程。而Vignini等[22]研究表明,NO浓度与血清17-茁雌二醇呈负相关,且卵泡液中高水平的NO浓度对卵泡和卵母细胞的发育有害。NO在女性生殖过程中所扮演的角色很难通过现有研究对其作出定论,但NO的表达与女性生殖过程在一定程度存在密切的关系,需进一步研究进行探讨。
综上所述,卵泡液促血管生成因子不仅可作用于卵泡膜血管内皮细胞直接或间接提高卵泡膜血管新生能力,促进卵泡的生长;还可通过复杂的信号转导途径作用于颗粒细胞影响卵子成熟和周期性排卵过程。卵泡液促血管生成因子在卵泡膜血管生成、卵泡发育及卵子成熟过程中扮演着十分重要的角色,是维持女性正常生殖功能的关键。同时,卵泡液微环境是一个十分复杂、包含许多种细胞因子的生物学微环境,各种细胞因子之间的作用难以以其单独效应简单综合,卵泡液促血管生成因子在生殖与发育过程中的总体效应,还需更多的研究加以论证。
作者：王志强 倪亚莉 柴三明 单位：甘肃省妇幼保健院生殖医学中心
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