1洗脱液的脱色和脱盐
由于色素成分复杂，所以往往以相对值来表示，通常的做法是将料液在各波长扫描，找出其中最大吸收峰的位置，以此波长处的吸光值变化作为脱色效果的考察依据［8］。脱色率(%)=［(A0－A)/A0］×100%式中:A0:吸附前的吸光值;A:吸附后的吸光值。棕黄色的莽草酸发酵液洗脱后为棕黄色，需进行脱色。本实验选用HZ-816大孔吸附树脂进行动态脱色，根据洗脱液的量和树脂的吸附能力来确定吸附树脂的用量，控制流速。鉴于洗脱液中含有大量氯化铵，会影响莽草酸结晶，故需脱盐。本实验选择H型732强酸性阳离子交换树脂进行脱盐，根据洗脱液的量计算NH+4的浓度范围，再根据732树脂对NH+4的交换容量计算732树脂的用量，控制流速，进行脱盐。
2莽草酸结晶和纯度检测
2.1莽草酸结晶
莽草酸溶解度为180mg/mL，根据洗脱液浓度计算饱和体积为4mL，将洗脱液旋转蒸发至莽草酸饱和体积，取出倒入平皿，在4℃下结晶。将结晶和剩余少量浓缩液分开，冰乙醇洗涤，结晶后再以少量热水溶解，进行再结晶。
2.2莽草酸纯度检测
将莽草酸结晶配制成300mg/L溶液，采用HPLC检测其纯度［9］。实验所用HPLC柱为4.6mm×250mmODS-2柱，流动相是纯净水(以H3PO4调节pH至2.0);体积流量为0.8mL/min;检测波长为217nm;柱温为28℃;进样量为20μL。
3结果
3.1阴离子交换树脂的筛选
由于莽草酸的pKa为3.87±0.6，所以在pH大于4.87时，莽草酸在溶液中均呈阴离子状态，所以本实验选择以强碱性阴离子交换树脂对其进行吸附。如图1所示，4种树脂对莽草酸的吸附能力各不相同，尤以717强碱性阴离子交换树脂吸附容量最大。因此，本实验选用717强碱性阴离子交换树脂进行大肠杆菌DHPYAAS-T7发酵液中莽草酸的分离纯化。
3.2pH值对阴离子树脂交换容量的影响
在不同pH条件下，莽草酸会存在分子、部分解离或完全解离等不同状态，所以pH值对于离子交换树脂吸附目的产物的影响极大。本实验选用3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.07个不同pH值来考察717强碱性阴离子交换树脂吸附莽草酸的最适pH。由图2可见，当pH值为6.0时，莽草酸吸附量达到最大。莽草酸pKa为3.87±0.6，在pH值为6时，莽草酸是呈完全解离状态存在，能被717强碱性阴离子交换树脂完全吸附。
3.3717树脂对莽草酸的动态吸附及洗脱曲线
将经过预处理并调节pH值至6.0的发酵液进行动态吸附，层析柱规格为3.0cm×30cm，717树脂湿树脂的装填量为120mL(100g湿树脂)，发酵浓缩液上样浓度6.46g/L，体积流量为2mL/min，每一个试管的收集时间为5min，吸附至饱和，绘成动态吸附曲线(图3)。吸附饱和后，以去离子水冲洗柱床除杂，再以浓度为1.0mol/L的NH4Cl进行洗脱，体积流量为2mL/min，得到洗脱曲线(图4)。收集15～40管，共计160mL，测定莽草酸含量为4.99g/L，回收率为91.7%。
3.4洗脱液脱色及脱盐
将前面所述160mL收集液输入脱色柱中，层析柱规格为2.0cm×30cm，HZ-816大孔吸附树脂用量为55mL，体积流量为2mL/min，每一个试管的收集时间为5min。脱色曲线如图5所示。将脱色液收集，共获得190mL脱色液，莽草酸浓度为4.15g/L，回收率为98.8%。再将脱色液以一定流量输入732阳离子树脂脱盐柱中，层析柱规格为3.0cm×30cm，732树脂的装填量为120mL(90g)，体积流量为2mL/min，每管收集时间5min，当出口处流出液pH呈酸性时开始收集，共获得248mL体积，莽草酸浓度为3.16g/L，回收率为98.3%。
3.5莽草酸结晶和纯度检测
经脱色、脱盐后，将收集的莽草酸洗脱液进行结晶，获得晶体408mg，进行HPLC测定纯度，如图6所示，该样品纯度为98.6%。
4讨论
通过植物提取莽草酸的技术已经成熟，但生产工艺复杂，成本较高。我们实验室构建了一株高产莽草酸的基因工程菌(大肠杆菌DHPYAAS-T7)来生物合成莽草酸，似乎未见有报道。离子交换树脂提取分离技术所用设备简单，操作方便，生产连续化程度高，且对浓度低的样品也能富集，得到的产品往往纯度高，且树脂能多次循环使用，成本低。文献报道在植提莽草酸时使用717强碱阴离子树脂进行吸附，效果较好［10］。一般认为强碱性阴离子交换树脂对样品溶液pH没有要求，但本实验发现:莽草酸溶液pH大于6.0时，717阴离子交换树脂吸附量最大。其原因可能是pH大于6.0时，莽草酸才能完全电离成负离子，这样更容易与树脂的阴离子交换。洗脱后的发酵液仍是棕黄色，我们选用HZ-816大孔吸附树脂以除去大量的色素，洗脱液中可能存留洗脱剂NH4Cl，我们选用732阳离子树脂脱盐，脱色及脱盐回收率均较高。
作者：王慧 袁超 陈凯 窦洁 方宏清 周长林 单位：中国药科大学生命科学与技术学院 军事医学科学院生物工程研究所
