在白酒的酒精体积分数60%、提取温度70,℃、固液比(g﹕mL)1﹕10的条件下，用分光光度法分别测定提取时间为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0,h时总黄酮的提取量．在白酒的酒精体积分数60%、提取温度70,℃、提取时间1.5,h的条件下，用分光光度法分别测定固液比(g﹕mL)为1﹕10、1﹕15、1﹕20、1﹕25、1﹕30时总黄酮的提取量．在固液比(g﹕mL)为1﹕15、提取时间1.5,h、提取温度70,℃条件下，选取白酒的酒精体积分数为38%、42%、60%、70%进行单因素实验，得到的样品在冰箱冷藏区放置4,d后，用分光光度法测定总黄酮的提取量．
1.高效液相色谱法检测黄酮提取量
PC–2000型高效液相色谱，紫外检测器，反相C18柱(250,mm×4.6,mm，5,μm)，流动相甲醇与0.4%磷酸体积比40﹕60，柱温40,℃，流量0.5,mL/min，检测波长280,nm/350,nm，进样量20,μL．以芦丁为标准，采用标准曲线法检测黄酮的含量，各峰的峰面积记为An代入标准线性回归方程计算出每种黄酮的浓度cn，然后按式(2)计算出每种黄酮的含量Mn(mg/g)．
2讨论
2.1影响总黄酮提取量的单因素实验结果
2.1.1提取时间对总黄酮提取的影响
不同提取时间对总黄酮提取量的影响如图1所示．从图1可以看出，随着提取时间的增加，总黄酮提取量先增加后减少，当提取时间为1.5,h时，提取量最高，因此最佳的提取时间为1.5,h．
2.1.2固液比对总黄酮提取的影响
由图2可看出：固液比(g﹕mL)由1﹕10增加到1﹕15时，总黄酮的提取量增加了1.5,mg/g，而此后直至增加至1﹕30，提取量增加缓慢．最高的提取量时的固液比为1﹕25，但由于其提取量与1﹕15相差不大，考虑到生产成本，固液比(g﹕mL)采用1﹕15较为合适．
2.1.3酒精体积分数对总黄酮提取的影响
不同酒精体积分数对总黄酮提取量的影响如图3所示．从图3中可以看出，总黄酮的提取量随着白酒酒精体积分数的升高而升高，最佳酒精体积分数为70%，总黄酮的提取量为4.3,mg/g，酒精体积分数为42%和38%的白酒的总黄酮提取量相差不大，酒精体积分数为42%的白酒的总黄酮提取量为3.2,mg/g．酒精体积分数为70%的白酒由于其度数过高不能直接饮用，且酒精体积分数为70%和42%的白酒的数据相差不大，因此可直接选用酒精体积分数为42%的白酒作为提取剂．
2.2油松花粉的浸出实验
分别用75,mL和150,mL酒精体积分数为70%的白酒、75,mL酒精体积分数为42%的白酒浸泡5,g油松花粉，浸泡时间为3、5、10、15、20,d，得到的样品在冰箱冷藏区放置4,d后，使用分光光度法检测总黄酮的溶出情况，结果如图4所示．从图4中可以看出，150,mL酒精体积分数为70%的白酒浸出量高于75,mL酒精体积分数为70%的白酒的浸出量，但其差别并不大，可见固液比对浸出量的影响较小，而酒精体积分数为70%的白酒的浸出能力要高于42%的白酒，约是后者的1.7倍．使用酒精体积分数为70%的白酒作为提取剂时需要进行稀释，市场上饮用酒的酒精体积分数为42%，需将酒精体积分数为70%的白酒稀释两倍，稀释后，酒精体积分数为70%的白酒的提取效果与42%的白酒的提取效果相当，因此不如直接使用酒精体积分数为42%的白酒进行浸提．
2.3黄酮酒制备工艺的确定
加热法的较佳工艺为提取时间1.5,h，固液比(g﹕mL)为1﹕15，白酒酒精体积分数为42%，总黄酮的提取量为3.2,mg/g．浸提法的较佳工艺为采用酒精体积分数为42%的白酒直接浸泡，固液比(g﹕mL)为1﹕15，浸泡时间为10～15,d．浸提法得到的较佳样品的提取量为1.9,mg/g．综合加热法与浸提法的结果可知，虽然加热法的提取量较大，但由于加热法本身热耗较大，在得到较高提取量的同时也加大了成本的投入，二者量上的差距并不值得在热耗上的投入，因此从生产成本方面考虑使用浸提法较为合适．
2.4高效液相检测结果
选取酒精体积分数为70%的白酒提取液(最佳提取条件)、酒精体积分数为42%的白酒提取液、酒精体积分数为42%白酒浸出液、酒精体积分数为70%白酒浸出液为检测的样品，各样品在冰箱冷藏区放置4,d后在1.2.3的条件下用液相进行含量检测．依据黄酮类物质在280、350,nm左右为典型吸收峰[12]，因此同时出现在两个波长下的峰为黄酮峰，其他峰为杂质峰，酒精体积分数为42%白酒的提取液分别在280,nm和350,nm下检测，结果如图5所示．图5中所使用的流动相组成为甲醇与0.4%磷酸体积比为40﹕60，实验中发现，增大0.4%磷酸比例时，4.7,min与5.1,min的峰不会被洗出，减小比例时，两峰则缔合到一起无法分离．虽然该条件并没有将黄酮完全分离，但可以达到定性的要求．因此，将该条件作为分离黄酮、鉴定黄酮组分的较佳条件．由图5可看出油松花粉中黄酮的种类为4种．各样品的黄酮种类及含量见表1．从表1中可以初步推断出4种样品中均含有4种黄酮，即在黄酮种类方面，提取工艺和浸提工艺没有差别，但在黄酮含量方面差别较大．4种样品中酒精体积分数为42%白酒浸出液中黄酮的含量最高为10.066,mg/g，其余样品均低于该值．因此从液相数据来看，采用酒精体积分数为42%的白酒直接浸出是最佳的制酒工艺，该方法得到的结论与分光光度法得到的结论一致．结合图3、图4与表1可以看出，液相色谱检测的4种样品的总黄酮的数据均高于分光光度法的数据，这是由于分光光度法是基于Al3+与黄酮裸露的羟基络合显色的原理而检测的，所检测到的黄酮多为游离状态，而液相色谱法则没有这方面的局限性，黄酮的游离态以及结合态都可以被检测出来，因而液相检测的数据较高．在自然界中黄酮多以结合态存在，且多数与糖苷结合极性较大，因此同样极性较大酒精体积分数为42%的白酒样品的检测数据最高.
3结论
初步推断出油松花粉中含有4种黄酮，分光光度法及液相色谱检测总黄酮含量时，结果有差异，但其得到的结论一致．制备油松花粉黄酮保健酒的最佳工艺为直接浸泡法，采用酒精体积分数为42%的白酒，固液比(g﹕mL)为1﹕15，浸泡时间为10～15,d．由于分光光度法检测到的黄酮多为游离态，易于人体吸收[13]，因此采用分光光度法检测总黄酮的浸出量为1.9,mg/g．
作者：郭丽梅 王盼盼 杨蒙 武首香 单位：天津科技大学材料科学与化学工程学院 天津现代职业技术学院
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