1多重PCR退火温度控制
以肠毒性大肠埃细菌、蜡样芽孢杆菌以及副溶血性弧菌为例，基于多重PCR反应系统设计以上三种病菌类型的退火温度为48~72°C，同样使用琼脂糖凝胶电泳检测方式，根据电泳图条带呈现的亮度情况选择适当的退火温度。1.2.8常规以及多重PCR检测敏感度对比测定选取的葡萄球菌、肠炎沙门菌和蜡样芽孢杆菌标准菌株基因组DNA浓度，并且使其变为20ng/μL，并且进行十倍稀释，保证敏感度测验的DNA浓度在2×10-2~2×10-10ng/μL，后在每个浓度中各选择2μl进行常规以及多重PCR检测对比。
2结果
2.1常规PCR检测与多重PCR检测灵敏度对比结果
通过常规PCR检测和多重PCR检测的敏感度比较，经过10倍稀释后的葡萄糖菌、蜡样芽孢杆菌标准菌株基因组DNA、肠炎沙门菌得知，常规PCR在DNA含量较低的情况下仍旧可以反映出清晰特异性的目的条带，而多重PCR只能扩增出葡萄球菌以及蜡样芽孢杆菌，当DNA浓度低于2×10-2~2×10-1ng/μL时，无法检测出蜡样芽孢杆菌，而低于2×10-2~2×10-3ng/μL时，只等对葡萄球菌进行扩增，DNA浓度不高于2×10-2~2×10-7ng/μL时候无法扩增。由此得知常规PCR检测敏感度为2×10-2~2×10-7ng/μL，多重PCR的检测敏感度是2×10-2~2×10-6ng/μL。对100例患者146份食品中毒样本进行以上两种检测，发现副溶血性弧菌均可检测出来，但是两种PCR检测对比分析后，常规PCR能从较多的样品中检测出这一细菌，而多重PCR检测相比而言从样品中检测出副溶血性孤菌的概率较低。
2.2常规PCR、多重PCR退火温度优化
常规PCR反应在退火温度不高的的情况下，例如50°C的退火温度，6种主要致病菌都能反映出特异性扩增条带，但条带亮度呈现效果不明显，而当温度较高，处在58°时反应出的电泳条带更为清晰，因此可以说温度较高的情况下达到的PCR检测结果也更为满意。但是温度过高，即到达62°C时，葡萄球菌产物反应不明显，并且容易导致肠炎沙门菌产物丢失。所以根据分析发现常规PCR检测保持58°C的退火温度能达到最好的检测效果。根据对蜡样芽孢杆菌、副溶血性孤菌以及肠出血性大肠埃希菌三种菌种的引物检测为例进行的多重PCR检测退火实验得知：多重PCR检测在退火温度为50°C时，以上三种致病菌的特异性扩增条带反映效果一般，仅能体现很低的条带亮度，但当温度到达62°C时，电泳条带的亮度反映情况良好，便于分辨，得到的PCR检测结果也更为确切。当温度到达70°C时，蜡样芽孢杆菌引物会发生丢失，所以得出多重PCR检测退火温度在62°C时效果最佳的结论。
3结语
由以上检测结果得知，传统的检测方式对于一些特殊病菌的培养和检测存在技术盲区，同时有敏感度弱、特异性低、检验工作量大、检测时间长等众多缺陷，难以满足对病菌食物起到检测和预防的目的，所以具有众多优势的多重PCR检测方式亟需进一步使用和优化。多重PCR检测技术首先应用于异基因脐带血干细胞治疗假肥大型肌营养不良症中。目前多重PCR诊断技术已经普遍用于基因组结构、基因座定位或者病源细菌检测等多种用途中，并且通过长时间的使用，其检测质量也得到的肯定，尤其是能够检测出副溶血性孤菌、单核细胞增生李斯特菌以及沙门菌方面能够在保证检测质量的前提下缩短检测耗时。通过以上实验研究得知常规PCR检测的敏感度在2×10-7ng/μL，所以高于多重PCR检测的敏感度，对于食物中含有的病菌检测也较为有效，但是消耗大量的试剂以及时间。多重PCR检测与其相反，虽然灵敏度不如常规PCR检测，但是能够缩短检测时间，并且能够同时检验出多种类病菌类型，所以将常规PCR检测与多重PCR检测相结合，取长补短的优化检测方式，建立一个具备高效、敏感、准确的PCR检测方式，能够使6中治病的主要病菌类型在最快时间内被全部检测出来。
作者：关桂英 王风朝 单位：山东莘县疾病预防控制中心检验科
