1方法
1.1致病力测定
(1)接种方法将叶片正面朝上均匀平铺到20cm×30cm的保鲜盒内。用大头针在每片叶片沿主脉一侧进行针刺，在直径2mm范围内均匀针刺5下，用直径5mm的打孔器沿菌落边缘打制成菌碟，置于针刺部位。接种时菌面朝下，与叶片紧贴。用吸饱蒸馏水的纸巾覆盖叶柄保湿。每个保鲜盒接种20片叶为1个重复，以接PDA培养基为对照，每个菌株作为1个处理，每个处理设置3个重复。接种后置于28℃恒温培养箱中保湿培养。荔枝果实经0.1%烯酰吗啉溶液浸泡5min后，自然晾干，将果实均匀放置于保鲜盒内，相互之间无挤靠。在果皮上直接接种菌碟，每个重复接种20个果实，以接PDA培养基为对照，每个处理设置3个重复。(2)指标及统计方法叶片接种3天、果实接种5天后，采用十字交叉法测量单叶和单果的病斑直径，并计算平均病斑直径。以病斑直径大小为依据，把各菌株的致病力分为4个等级:病斑直径=0cm，为无致病力;0cm＜病斑直径＜0.6cm，为弱致病力;0.6cm≤病斑直径≤1.2cm，为中致病力;病斑直径＞1.2cm，为强致病力。统计各菌株在4类不同病斑直径区间叶片或果实所占的百分比。平均病斑直径用SAS单因子完全随机分析，均值间采用Duncan检验［13－14］。以各病斑直径所占百分比及病斑直径为指标，进行聚类分析［15］。
1.2菌株生物学特性比较
依据致病力比较结果，选取致病力最强和最弱的2个菌株进行生物学特性比较研究。(1)菌丝形态和生长速度经单孢分离后的供试菌株长至3天，用直径0.5cm的打孔器打取菌碟，各菌株分别取1个菌碟接种于PDA平板中央，于28℃恒温培养，每天观察菌丝形态，用十字交叉法测量菌落的直径，计算菌落每天的平均直径。每个平板为1个重复，每个菌株设置3个重复。(2)分生孢子和分生孢子盘鉴定选取PDA平板培养7～14天的供试菌株，其菌落表面会长出黑色的分生孢子盘及橙黄色的黏孢团，挑取少量黑色小点及橙黄色黏状物置于滴有无菌水的载玻片上进行显微镜观察。(3)产孢能力取直径约0.5cm供试菌株的菌碟分别接种于含有100mLPDA液体培养基中，28℃恒温振荡培养，每个菌株设置3个重复。培养3～5天后，用孢子过滤器过滤收集孢子，定容至10mL，用血球计数板镜检孢子数。(4)孢子萌发率用无菌水配制浓度约为106个/mL供试菌株的孢子悬浮液。各取20μL孢子悬浮液，分别滴在载玻片左右两边，28℃恒温保湿培养，分别在培养3、6、9、12、15、18h时镜检分生孢子萌发情况，记录萌发孢子数和未萌发孢子数。每个时间点设置3个重复，每个重复观察100个视野，计算孢子萌发率(萌发孢子数占总孢子数的百分数)，计算每个处理的平均值。
2结果与分析
2.1菌株致病力比较验证
2.1.1病斑直径差异用供试的11个胶孢炭疽菌菌株对妃子笑幼叶、果实及大丁香幼叶进行离体接种，结果如表2所示。同一菌株对妃子笑和大丁香2个品种叶片的致病力有一定差异，同一菌株对妃子笑的叶片和果实也表现出不同的致病力;不同菌株间对相同荔枝品种叶片和果实的致病力大部分存在显著差异。从对叶片和果实的侵染能力看，菌株0977－19－2产生的病斑直径均大于1.2cm，属最强致病力菌株;菌株Litan－5和09619－1－1产生的病斑直径均小于0.6cm，且两者间无显著差异，属最弱致病力菌株。除0977－19－2外，其他菌株侵染果实产生的病斑直径均小于侵染叶片产生的病斑直径，说明多数菌株对叶片和果实的侵染力存在差异，即对叶片的侵染能力强于果实。综合分析看，胶孢炭疽菌的致病力与其地理来源和寄主组织来源没有必然相关性。2.1.2不同发病级别寄主组织上菌株的比率差异由于寄主组织的不同病斑直径所占的百分比可反映出集中发病组织的情况，因此分别对叶片和果实及各自的病斑直径关系进行了分析，结果如表3所示。当病斑直径≥0.6cm时，各菌株在叶片上出现的比率远大于其在果实上出现的比率;当病斑直径＜0.6cm时，大部分菌株在叶片上出现的比率远小于其在果实上出现的比率，说明各供试菌株对叶片的致病力强于对果实的致病力。2.1.3聚类分析在聚类距离(欧氏距离)为3.3左右时，可将11株菌株分为4类:第1类含菌株0977－19－2，对果实与叶片都表现强致病力，果实和叶片在病斑直径≥0.6cm时所占的百分比都在80%以上;第2类含菌株09626－3－1－1和09626－4－1－1，对叶片和果实都表现为中等致病力，叶片和果实在病斑直径≥0.6cm时所占的百分比都大于50%;第3类可分成两小类，菌株0958－8－6－1、09627－12－3－1、YongdaguoI－2－3对果实表现为弱致病力，对叶片表现为中致病力，叶片在病斑直径≥0.6cm时所占的百分比约为80%，果实在0cm≤病斑直径＜0.6cm时所占的百分比超过70%;其余的0958－7－1－1、09724－13－2、0977－15－1菌株对果实与叶片均表现中致病力，叶片在病斑直径≥0.6cm时所占的百分比约为80%，果实在0cm≤病斑直径＜0.6cm时所占的百分比为65%以上;第4类含菌株09619－1－1和Litan－5，对果实和叶片都表现为弱致病力(图1)。综合平均病斑直径、不同病斑直径组织的所占百分比及聚类分析结果，强致病力菌株有1株(0977－19－2)，弱致病力菌株有2株(09619－1－1、Litan－5)，其余菌株致病力均属中等。
2.2不同致病力菌株的生物学特性比较
根据不同菌株在荔枝叶片和果实上的致病力试验结果，选择强致病力菌株0977－19－2和弱致病力菌株09619－1－1进行部分生物学特性比较。2.2.1菌丝形态和生长速度的比较将单孢纯化的强致病力菌株0977－19－2和弱致病力菌株09619－1－1在PDA平板上28℃培养，初期平板上长出的菌丝为白色绒状，培养至第7天时菌丝布满全皿。随菌龄的增长，菌丝逐渐由白色转为灰白色，最后变成黑褐色。2个菌株生长速度无明显差异。2.2.2分生孢子和分生孢子盘的比较强致病力菌株0977－19－2分生孢子盘呈碟形;分生孢子盘上密生的棒状分生孢子梗无色，不分支，由顶端生出分生孢子，未见刚毛。分生孢子单胞，无色，椭圆形，两端钝圆，中间具1个或多个油球，内含颗粒物，大小12.7～15.6μm×4.1～5.1μm。弱致病力菌株09619－1－1分生孢子盘散射状;分生孢子梗紧密排列在分生孢子盘上。分生孢子单胞，无色，椭圆形，一般具1个油球，少数有2个，大小为12.3～15.8μm×3.2～4.6μm。2.2.3产孢量的比较从产孢量结果看，相同条件下强致病力菌株0977－19－2的产孢量约为17.750×106个/mL，弱致病力菌株09619－1－1产孢量约为5.635×106个/mL，前者的产孢量显著高于后者。2.2.4孢子萌发率的比较培养3h后，2个菌株的分生孢子开始萌发。随时间的延长，孢子萌发率都呈增长趋势;培养6h后强致病力菌株0977－19－2分生孢子萌发率达11.40%，弱致病力菌株09619－1－1的分生孢子萌发率仅为4.20%;培养18h时，强致病力菌株0977－19－2的孢子萌发率达89.65%，弱致病力菌株09619－1－1的孢子萌发率为65.43%。在整个观察期内，强致病力菌株0977－19－2的孢子萌发率都明显高于弱致病力菌株09619－1－1。
3结论与讨论
本实验室曾采用离体接种法测定了从广东、云南、海南、广西、四川、福建等6省分离的91个荔枝胶孢炭疽菌菌株对妃子笑幼叶的致病力［12］，本试验随机挑选了其中11株，再次利用不同品种荔枝叶片和果实进行致病力验证。2次结果均显示，供试菌株存在明显的致病力分化。不同菌株对同一品种的相同组织致病力也表现差异，相同菌株对同一荔枝品种叶片和果实的致病力也有差异，但菌株的致病力强弱都处于同一档次内。综合各供试菌株在不同荔枝品种叶片和果实上的致病力表现，把供试菌株分为强、中、弱和无致病力4种类型;同一菌株接种叶片和果实，致病力存在差异，表明致病力表现与接种的组织部位有关，这可能与接种组织的抗侵染能力有关系。除个别菌株外，来源于叶片的菌株侵染同一品种的不同组织时，侵染力差异不大，但菌株间的致病力差异显著。来源于果实的4株菌株的致病力差异不大，但大部分菌株在侵染相同荔枝品种的不同组织时侵染力表现较大差异;无论对不同品种还是同一品种的不同组织，菌株的致病力基本表现一致，这与前期的研究结果一致。与弱致病力菌株相比，强致病力菌株在相同品种的不同组织及不同品种的相同组织上都表现强致病性。通过对强、弱致病力菌株的生物学特性比较发现，二者菌丝形态相似，生长速度无明显差异，但二者的分生孢子和分生孢子盘大小及形状有一定差异，且强致病力菌株0977－19－2的产孢量和孢子萌发率均明显高于弱致病力菌株09619－1－1。Wyllie［16］等认为致病力不同的黑白轮枝菌生理特性存在极大的差异，朱荷琴［17］也曾对棉花黄萎病菌不同致病力菌株的生物学特性进行了比较，发现强致病力菌株在生长量、产孢量、产毒量等方面都高于弱致病力菌株。因此菌株的致病力差异与其生物学特性可能有一定的相关性，这有待于增加不同致病力级别的菌株做进一步验证。此外，菌株间致病力差异不仅仅只与其生长量、产孢量、分生孢子萌发率有关，与菌株本身的遗传特性也有很大关系，本文仅就某些生物学因素进行了一些探讨，对致病过程、机理的深入研究尚需更多具体的工作。
作者：张新春 彭元科 王家保 单位：中国热带农业科学院环境与植物保护研究所
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