【摘要】抗体疗法在抗病毒感染中发挥重要作用，有助于预防和缓解病毒疾病。传统的多抗制剂逐步被高效的单抗取代。新兴的鸡尾酒单抗和双特异性单抗针对多个病毒靶点，克服了病毒逃逸问题。抗体工程的进步促成了大量新型单抗的产生，伴随着病毒生物学特性及中和表位的深入了解，单抗的潜在靶点进一步扩展。此外，低成本生产平台的进步，将使得抗病毒单抗更加廉价从而得到广泛应用。
【关键词】抗病毒免疫；血清疗法；单克隆抗体；抗体工程；综述
【中图分类号】Ｒ３７３【文献标识码】Ａ【文章编号】１６７３－５２３４（２０１５）１２－附页２－０５
被动免疫基于使用恢复期或免疫后人或动物的血清，以预防或控制感染。疫苗诱导免疫不仅需要时间，还依赖于宿主启动免疫应答的能力，而被动免疫可以提供即时的保护，也不依赖接受者的免疫状态。２０１４年基因工程抗体成功救治２名埃博拉病毒病感染者震惊了世界［１］。其实，抗体疗法具有悠久的历史。自１９世纪９０年代开发出抗白喉血清后［２］，人们发现恢复期病人的血清可用于防治多种病毒疾病，包括麻疹、流感、水痘－带状疱疹、玻利维亚出血热、阿根廷出血热以及拉沙出血热［３］。此外，治疗动物疫病也使用恢复期动物的血清，其中１９世纪８０年代治愈牛瘟的案例被称为开创性尝试。如今，几种抗病毒免疫球蛋白产品仍然在美国市场上应用，包括抗狂犬病毒、巨细胞病毒、ＨＢＶ、ＨＣＶ、牛痘病毒、水痘－带状疱疹病毒以及呼吸道合胞病毒的高免球蛋白制剂。多克隆制品的共同缺点是其组份中包含许多非中和抗体，且大都来源于动物［３］。此外，由于使用血制品有风险，多克隆血清需要经过纯化处理。多克隆血清还存在批次之间差异大，以及难以获得免疫供体等问题［４］。单克隆抗体的研制为替代多克隆抗体制剂提供选择。近年来单克隆抗体研究和应用突飞猛进，本文重点介绍单克隆抗体在病毒感染中的应用进展。
１单克隆抗体的研制
１９７５年，Ｋｏｈｌｅｒ和Ｍｉｌｓｔｅｉｎ研制出了杂交瘤，此后，单抗生产技术大幅提高，单抗的产业化造就了大量临床前抗病毒单抗的研制。现在可以采用诸如噬菌体展示的方法筛选最小免疫原性的全人源单抗，单体或者寡聚体形式的纯化衣壳糖蛋白和病毒颗粒是常用于筛选抗体库的两种诱饵抗原［３，５］。美国食品药品管理局批准的第一个抗病毒单抗是帕利珠单抗（Ｓｙｎａｇｉｓ／ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ），它是人源化的ＩｇＧ１抗体，用于高危婴儿预防呼吸道合胞病毒［６］。在帕利珠单抗之前，一种叫做ＲｅｓｐｉＧａｍ的抗血清制剂用于预防呼吸道合胞病。这种多抗制剂特异性较低，而且对婴儿较低的体重来说，所需剂量偏高［７］。帕利珠单抗减少了治疗婴儿所需的剂量，避免了混合血清的副作用，从而改善了呼吸道合胞病的治疗。
２抗病毒免疫
特异性抗体效价与抗病毒能力有关。抗体通过多种机制进行操控，这些机制由可变区或保守区介导。由抗体可变结构域介导的与目标抗原的特异性表位高度选择性结合是至关重要的特点［８］。抗体保守结构域包括Ｆｃ区，发挥其他重要的作用，包括抗体依赖的细胞毒性（ＡＤＣＣ）、抗体依赖的细胞吞噬作用（ＡＤＣＰ）和补体依赖性细胞毒性（ＣＤＣ）［８］。ＡＤＣＣ和ＡＤＣＰ由Ｆｃγ受体介导，而ＣＤＣ由补体级联蛋白介导，例如Ｃ１ｑ和Ｃ５。Ｆｃ区的另一功能是通过与新生Ｆｃ受体（ＦｃＲｎ）相互作用，延长抗体的半衰期（人ＩｇＧ是２１ｄ）［９］。抗体可以通过多种机制干扰病毒进入细胞［３］。一种机制是抑制病毒与细胞表面受体的结合，抗体与病毒包膜结合，从而干扰其与细胞受体结合的能力［１０］。抗体靶向受体或共受体，从而使得病毒的结合位点不可用，达到同样的效果［１１］。另一个机制是抗体靶向非受体结合区，从而进行结合后／融合前中和，干扰所需的细胞膜或内体膜的构象改变。病毒中和的其他机制包括抗体介导的病毒粒子交联，造成固定和凝集，或者抑制子代病毒的释放，例如抗流感病毒的抗体［１２－１３］。总之，当病毒表面足够数量的表位被抗体占据时，即发生病毒中和。这种"占据"模式，有时被称为"多击模式"，认为病毒粒子表面达到足够的抗体密度是中和的最重要因素，从而抑制病毒与细胞受体结合或者干扰内体或质膜融合过程［１４］。另一种中和的模式是"重要结合位点"模式，与单击或多击中和理论兼容，该模式认为中和依赖于靶向关键的结合位点，无需病毒表面达到高抗体密度［３］。抗体除了能直接干扰病毒进入细胞，还可以通过Ｆｃ效应子功能阻碍病毒感染。何种效应功能起到保护作用则依病毒不同而异。研究表明，对于ＨＩＶ－１不激活补体的中和单抗与野生型抗体具有相同的保护力［１５］。然而，当补体和ＦｃＲｎ均破坏时，相同抗体的体内保护力变弱［１５］。这些发现指出ＡＤＣＣ在ＨＩＶ中和过程中的重要作用，其他几种病毒的中和好像无需Ｆｃ效应功能，例如狂犬病病毒。在有些情况下，抗体也可以作为免疫调节子，研究已经表明有些单抗具有类似疫苗的效应：用ＩｇＧ２ａ型中和单抗对感染了小鼠逆转录病毒的小鼠进行短期免疫治疗，发现小鼠保持健康，并且拥有较强的体液和细胞免疫，具备长期的抗病毒保护性免疫。经单抗治疗过的小鼠产生内源性抗病毒抗体在注入的抗体消失以后，仍可以遏制病毒的传播，增强记忆细胞反应。使用单抗可以启动内源性长效抗病毒免疫，表明感染细胞抗体免疫复合物对被动免疫短期治疗介导的长期保护力具有重要作用［１６］。
３病毒逃避突变体
为了获得有效的免疫预防，需要考虑流行毒株的抗原变异性和潜在病毒逃逸突变体。甲流抗原漂移和转变会自然发生，因此这种考虑对甲流病毒异常重要；对于ＨＩＶ多种不同变种病毒的形成驱动免疫逃逸。ＲＮＡ病毒的ＲＮＡ聚合酶，不具备校正和修复功能，造成选择压力下抗性突变体的出现。体外实验表明在抗体选择压力下可以产生逃逸突变体，如抗基孔肯雅病毒的单抗［１７］。有趣的是，高通量测序也可从非特异性抗体处理过的病毒序列中检测到基孔肯雅病毒逃逸有关的突变残基，尽管比例极低（每个位点占所有核苷酸比例为０．０５％～０．２０％），表明选择压力使得少量的预先存在的病毒准种得以扩大［１７］。除了体外可以分离到病毒逃逸突变体，在体内也可以分离，比如从接受过抗Ｈ５Ｎ１单抗的小鼠肺中分离到流感Ｈ５Ｎ１逃逸突变体。此外，抗性ＲＳＶ突变体可以从接受过帕利珠单抗的病人体内分离：从接受了帕利珠单抗仍然有急性下呼吸道感染的婴儿中分离到的ＲＳＶ的核苷酸序列分析表明ＲＳＶ融合蛋白特异性突变，使得病毒逃避中和。第二代帕利珠单抗变种（ｍｏｔａｖｉｚｕｍａｂ）已经研发出来，大规模的三期临床研究正对这两种制剂进行比较。与帕利珠单抗治疗类似，含有ＲＳＶ衣壳蛋白上特定序列变化的抗性ＲＳＶ变种从体外得到，也可从接受过ｍｏｔａｖｉｚｕｍａｂ的ＲＳＶ患者身上获得［１８］。病毒逃逸的出现可能伴随病毒适应性的改变，这可影响体外和体内的病毒生长。突变可能使病毒逃逸突变体对特异性单抗具有抗性，但是生长和感染特性的改变可能会使病毒变弱，继而被宿主免疫系统清除［１９］。
４鸡尾酒单抗
覆盖不同毒株和预防病毒逃逸突变体，是研发被动免疫疗法中需要重点考虑的因素，因此，开发并且评估不同单抗组合。根据特异性和功能选择单抗，在广度和特异性方面它们互补，并且在结合抗原方面不存在竞争。如果单一单抗的靶表位对所有毒株并不保守，尤其是在多种动物病毒感染人的情况下，鸡尾酒单抗是必须的。例如，狂犬病毒属包含多种不同的毒株，它们在多种不同宿主中流行，像食肉类动物（狗，野生动物）和翼手目（蝙蝠）。严重暴露于狂犬病动物后及时施用狂犬病ＰＥＰ，包括人或马狂犬病免疫球蛋白（分别是ＨＲＩＧ和ＥＲＩＧ），可以使得未接种疫苗的受害者预防狂犬病和死亡［４６，４７］。Ｃｒｕｃｅｌｌ正在研发ＣＬ１８４，有望在ＰＥＰ中替代ＨＲＩＧ和ＥＲＩＧ的两种单抗的混合［２０］。这一鸡尾酒的设计应用两个主要标准：第一，单抗应涵盖广谱的变种毒株、靶向不同、非重叠的抗原决定簇、并且不竞争抗原的结合。第二，体外产生的对一种单抗有抗性的逃逸突变体应被另一种单抗中和，反之亦然［２１－２２］。除了这些抗狂犬病毒单抗，其他几种病毒病的单抗组合也正在研发，包括禽流感，研发两个靶向甲流Ｈ５Ｎ１血凝素分子的单抗。这些单抗针对不同的抗原表位，互相合作，覆盖逃逸突变体。两种单抗联合使用，全面覆盖不同的病毒分支，治疗后没有检测出逃逸突变体。同样，已经研发出两种非竞争性的抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ单抗组合。这种组合可控制免疫逃逸、扩展保护的广度、降低总抗体给药剂量。不仅有ＳＡＲＳ－ＣｏＶ的中和抗体的协同作用的报道，还发现两种、三种或者四种单抗联合使用针对ＨＩＶ－１包膜糖蛋白的不同抗原表位，可提高中和滴度２～１０倍。
５多价和多特异性单抗
对水痘－带状疱疹病毒、ＨＩＶ和狂犬病毒的研究发现，抗体效价是一个非常重要的因素。二价抗体的结合可以介导病毒颗粒交联，从而导致固定或凝集。已经表明，特定的抗原表位，例如单纯疱疹病毒（ＨＳＶ）可以被二价形式的抗体（完整的单抗，Ｆ（ａｂ＇）２）有效靶向，若使用单价抗体（ｓｃＦＶ，Ｆ（ａｂ）），则使得中和反应大大减少。Ｆ（ａｂ）片段介导的ＨＳＶ中和可以通过ＩｇＧ与鼠Ｆ（ａｂ）片段反应使得Ｆ（ａｂ）交联而得以恢复。这些发现表明这种单抗介导的中和依赖于糖蛋白Ｂ（ｇＢ）三聚体的交联，ｇＢ三聚体的固定抑制膜融合信号的激活。因此，只有二价单抗衍生物才能表现出足够的体外中和活性［１３］。在自然界中，多价是通过免疫球蛋白亚单位的二聚化或多聚化实现的，从而引起多聚化或分泌性ＩｇＡ或ＩｇＭ抗体。通常认为ＩｇＭ抗体具较低的结合亲和力，对初级免疫反应非常重要，分泌型ＩｇＡ（ＳＩｇＡ）在所有黏膜分泌物中是最主要的保护性抗体。它的装配要求有些复杂，需要浆细胞产生二聚体ＩｇＡ，还需要上皮细胞产生分泌成分，这使得这些单抗的研发进展缓慢，虽然有可能在哺乳动物细胞表达系统中表达，但是这一方法难以规模化。然而，也有报道植物系统生产重组的分泌型抗体，给未来针对黏膜感染基于ＳＩｇＡ的的预防带来希望［２３］。一般来说，二价抗体的结合有助于中和表面纤突密度较高的病毒，例如ＲＳＶ和流感病毒［２４］。相反，ＨＩＶ表面纤突数量较少，推测这种低密度的ｇｐ１６０三聚体干扰单抗与病毒的二价结合，难以有效中和病毒［２５］。成熟的ＨＩＶ颗粒表达１０～１５个病毒纤突，它们随机，彼此间相距太远难以与二价抗体结合［２５］。然而，通过改变抗体构型，多价结合在理论上是可行的，比如，研究表明２Ｇ１２单抗的二聚体形式提高了中和能力［２６］。多价单抗提高中和效率的其他例子还包括抗ＨＩＶ单抗２Ｆ５和２Ｇ１２的多聚体ＩｇＡ和ＩｇＭ形式。同型二价结合的另一种替代方法是异型二价结合，如ｓｃＦｖ－Ｆｃ分子，可以二价结合靶向ｇｐ１２０的一个ｓｃＦｖ臂，和靶向ｇｐ１６０的ｇｐ４１亚单位的第二个臂［２７］。免疫黏附素的特殊构型可以克服ＨＩＶ表面纤突二价结合的缺乏［２７］。还有一项研究调查了几种新型的四价双特异性抗体，可同时靶向两个不同的ＨＩＶ共受体ＣＣＲ５的抗原表位［２８］。这些分子基于Ｍｏｒｒｉｓｏｎ型双特异性抗体，全部ＩｇＧ通过灵活的连接子与ｓｃＦｖ连接。双特异性抗体保持它们对两种抗原表位的结合能力，可同时阻止富含ＣＣＲ５的ＨＩＶ毒株的两个泊位，与亲本单特异性抗体相比，抗病毒能力提高１８～５７倍。有趣的是，原型四价ＣＣＲ５抗体对具单亲本抗性的毒株具有抗病毒能力。增加的化合价和双特异性增强了抗病毒能力，也增加了抗病毒耐药性阈值［２８］。通过融合小分子和抗体也可产生多特异性抗体，如构建的一种重组蛋白多聚体，结合了抗ＨＩＶ单抗ｂ１２和小抗菌蛋白蓝藻的功能。这两种分子与抗原的结合没有竞争关系，因为ｂ１２识别ＨＩＶｇｐ１２０的构象表位氨基酸，而蓝藻结合糖链抗原表位［２９］。与双特异性ｂ１２－蓝藻构建相似的策略也可应用于其他分子，比如，双功能ＨＩＶ融合抑制子（ＢＦＦ１）分子，是通过将抗ＣＣＲ５或者抗ＣＤ４抗体与小融合抑制子连接而成，巨细胞病毒特异性抗体与细胞毒素（去糖基化蓖麻毒素Ａ链）相连接而构建成靶向小鼠巨细胞病毒感染细胞的多聚体分子［３０］。
６抗体工程
抗体可变区可以加工成小片段，包括ｓｃＦｖ和Ｆ（ａｂ）分子，它们的产生不需要昂贵的真核表达系统［３１－３２］。已经有针对这种小抗体片段的抗病毒活性研究，包括骆驼ＶＨＨ区。单峰驼和美洲驼的血清含有一种独特的抗体，不含轻链。这些骆驼重链抗体引起研究者极大的兴趣，因为它们可以通过单一的ＶＨＨ区识别抗原，这种ＶＨＨ区可以通过价格低廉的细菌或者酵母表达系统获得。已经研究出抗几种传染性疾病的ＶＨＨ，比如ＨＩＶ－１侵入抑制剂。除了骆驼家族的免疫球蛋白重链，在软骨鱼类（鲨鱼，鳐鱼）上已发现单结构域抗体［３３］。鲨鱼抗体，也称为免疫球蛋白新抗原受体（ＩｇＮＡＲ），已被开发可以抗乙肝病毒和埃博拉病毒［３３－３４］。已有工程学方面的努力旨在修饰抗体可变区或者恒定区，比如继帕利珠单抗的识别（Ｓｙｎａｇｉｓ；ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ／Ａｂｂｏｔｔ）以后又发展了第二代ｍｏｔａｖｉｚｕｍａｂ（ＭＥＤＩ－５２４；ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ），它拥有亲和性成熟的互补决定区（ＣＤＲ）。此外，ＭＥＤＩ－５７７单抗（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）是第三代ｍｏｔａｖｉｚｕｍａｂ，目前正在进行临床试验研究，其Ｆｃ区由于改造而延长了半衰期［３５］。Ｆｃ效应子功能的优化是抗体工程的重点。位点特异性突变和去糖基化这两个主要方法应用到抗病毒抗体工程，大大增强了与ＦｃＲＩＩＩａ或ＦｃＲＩＩａ的结合。比如，已经对与ＦｃＲＩＩＩａ和ＦｃＲＩＩａ具广泛亲和性的１１个抗ＨＩＶ单抗ｂ１２的突变体进行了研究，与原有的ｂ１２抗体相比，所有突变体与主要活性受体（ＦｃＲＩＩＩａ和ＦｃＲＩＩａ）的亲和性增强，抑制病毒的能力也增强［３６］。在某些病毒疾病的应用中，需要加以修饰以削弱或消除特异性Ｆｃ效应功能，比如，改变Ｆｃ区削弱或消除感染的抗体依赖性增强（ＡＤＥ）的方法。ＡＤＥ在一些传染性疾病中是公认的现象，包括各种黄病毒感染，如西尼罗河热病毒和登革热病毒。主动免疫和被动转移抗体都可以引起这种现象，导致在中和性抗体出现的情况下增强对病毒的吸收。病毒特异性抗体增强病毒的侵入，在某些情况下也通过与Ｆｃγ或补体受体相互作用促进病毒在单核／巨噬细胞和粒细胞中的复制。研究推测ＡＤＥ是登革出血热和登革休克综合症发生的机制，二者是二次异位感染和母体转移抗登革热抗体的婴儿中常见的临床症状。登革热病毒包括４种血清型，暴露一种血清型的病毒后产生的抗体会影响再次暴露于同种或者其他血清型的病毒的应答［３７］。被动转移高剂量血清型特异性抗体可以消除病毒血症，然而，低剂量抗体或者交叉型多抗或单抗可能加重疾病［３７］。相反，经遗传改造过的单抗变种不能结合Ｆｃγ受体，对ＡＤＥ引起的致死性挑战具有预防和治疗作用。
７研究进展
发现有广泛中和不同ＨＩＶ毒株的人单抗使得反向遗传方法生产疫苗成为可能。人类对ＨＩＶ－１感染的血清学反应靶向病毒的内部和囊膜蛋白，但是只有靶向ＨＩＶ囊膜蛋白ｇｐ１６０的抗体可以中和病毒。除了序列多变性和糖蛋白保护外，构象的灵活性也是制约ＨＩＶ－１疫苗研发的主要障碍。然而，靶向特定抗原表位的单抗具有保护性表明具有该种抗体的疫苗会拥有相似的效果。这些广谱中和单抗直接针对ｇｐ１２０或者ｇｐ４１。设计抗原表位类似物以启动免疫后对这些中和抗原表位的应答。最近发现了具有ＶＨ１－６９型重链广谱中和单抗，类似的策略也可应用于开发抗流感疫苗。研究发现这些单抗可以中和多种Ａ型流感１组病毒，并且单抗在与Ｈ１和Ｈ５血凝素（ＨＡ）形成的复杂的晶体结构呈现出血凝素茎部具有高度保守的抗原表位［３８］。之后的研究发现具有抗２组病毒广谱中和活性的单抗靶向的血凝素茎部保守抗原表位与１组ＶＨ１－６９抗体识别的表位是不同的［３９］。目前的疫苗限于针对季节性流行毒株，与之相反，靶向１组和２组病毒的单抗互补，因此使得研发广谱流感疫苗成为可能［３８－３９］。抗病毒单抗的应用还包括中枢神经系统感染，研究已经发现几种单抗在缓解既有的神经疾病方面具有前景，包括西尼罗河病毒和亨德拉病毒感染［４０］。然而，由于血脑屏障的存在，神经传染性疾病中抗体的使用往往受到限制，尤其像狂犬病，血脑屏障保持大体完整。临床上ＰＥＰ对狂犬病患者无效，因此向中枢神经系统输入治疗性单抗有待进一步研究。
８前景
多抗逐步被单抗代替，例如乙型肝炎免疫球蛋白（ＨＢＩＧ）、水痘－带状疱疹免疫球蛋白（ＶＺＩＧ）和狂犬病免疫球蛋白（ＲＩＧ）。ＲＩＧ进入世界卫生组织成人和儿童基本药物目录，单抗的使用有助于缓解发展中国家抗血清供应不足，从而促进实现联合国千年宣言的愿景。然而，若要生产广泛使用的单抗产品必须慎重考虑生产费用。一些疾病有相应的廉价药物和疫苗，单抗相对高的费用和保护的短暂性阻碍了其广泛使用，比如预防ＲＳＶ的帕利珠单抗五个月剂量的花费高达６０００英镑／人。抗病毒单抗的使用受到限制，特别在低收入国家，因此，为了适合发展中国家的情况，目前正努力开发低成本的生产平台，尤其是转基因植物的应用为几种单抗制品的广泛应用提供希望。
作者：郑学星 张渭蛟 韩慧 高玉伟 杨松涛 夏咸柱 侯小强 郑文文 单位：山东大学公共卫生学院 军事医学科学院军事兽医研究所 济南市口腔医院 北京军区总医院 聊城大学生命科学学院
