1材料
1．1试剂干燥日高昆布(LaminariajaponicaAresch)(购于日本北海道，上海市自然博物馆杭金欣副研究员鉴定);甲醇、乙醇、丙酮、冰醋酸、氯化钾、氯化钠、氯化钙等试剂均为国产分析纯;PBS、Bouin等自制。1．2仪器洁净操作台(苏净集团安泰有限公司);F-820自动血细胞计数仪(Sysmex);BH-2电子显微镜(olympus);CP224S精密天平(Sartorius);台式离心机(上海安亭科学仪器厂)。1．3动物BALB/c小鼠，SPF级，雄性，6～8周龄，体质量(20±2)g〔购自军事医学科学院实验动物中心，动物合格证号:医动字SCXK-(军)2007-004〕，实验室温度:20～24℃，相对湿度40%～70%;小鼠自购入后自由进食和进水，食物通过辐照灭菌，水通过高压高温灭菌，隔天更换1次垫料。
2方法
2．1褐藻糖胶的制备取日高昆布，清水洗净，风干后磨成粉末过20目筛。采用酸提醇沉法从日高昆布中提取褐藻糖胶［8-9］，然后再分别采用苯酚硫酸法［10］、硫酸钡比浊法［11］测得褐藻糖胶总糖含量为(42．63±0．78)%、褐藻糖胶硫酸根含量为(21．55±0．23)%。将褐藻糖胶用蒸馏水配制成浓度为1g·L－1的贮备液，滤过除菌，于－20℃冰箱中保存，1周内有效，临用前用注射用灭菌水稀释成所需浓度。2．2模型建立军事医学科学院放射医学研究所60Co-γ射线照射源，照射时小鼠置有机玻璃分隔匣内，离源4．0m，根据测定指标对射线剂量的要求，一次全身照射，照射剂量为7．5、6．0或5．5Gy。剂量率为2．29Gy·min－1。2．3实验分组小鼠常规饲养5d适应环境后，随机分为正常对照组、照射对照组、褐藻糖胶低、中、高剂量(灌胃50、100、200mg·kg－1·d－1)照射组，每组10只;对照组给予同体积的生理氯化钠溶液。每天固定时间腹腔注射给药，连续3d，最后一次给药后24h进行照射。2．4脾脾指数脾组织结构及脾集落生成单位(CFU-S)的测定7．5Gy照射后，于第8天颈椎脱臼处死小鼠，取出脾脏，计算脾指数、观察脾脏组织结构改变。脾指数的计算方法如下:脾指数=脾质量(mg)/体质量(g)CFU-S的测定采用内源性脾结节生成法:将脾脏放入Bouin氏液中固定，24h后计数脾脏表面结节数，1个脾结节表示1个CFU-S单位，正常对照小鼠脾脏表面光滑无脾结节生成，γ射线照射后小鼠脾脏萎缩，脾脏表面肉眼可见白色的突起状脾结节。2．5骨髓有核细胞计数6．0Gy照射后，于第9天将小鼠颈椎脱臼处死，置超净工作台，解剖小鼠，取其一侧股骨，用4号针头吸1mlPBS反复冲洗骨髓腔(即为1根股骨中的骨髓有核细胞数)，离心弃上清，加入红细胞裂解液，静置5min，1200r·min－1离心8min，弃上清，重新用PBS混匀细胞;用血球计数板在显微镜下参照白细胞计数方法，计数有核细胞数2．6外周血细胞计数5．5Gy照射后，于第1、3、7、14、21、30天尾静脉取血，具体方法如下:将小鼠固定并充分暴露其尾部，用乙醇棉擦拭消毒，用4号针头扎入其尾静脉中，取流出的血液20μl，用血细胞分析仪测定外周血白细胞(WBC)数、红细胞(ＲBC)数、血红蛋白(HGB)数及血小板(PLT)数。2．7数据分析实验所得数据用x珋±s表示，采用CHISS统计软件，各组数据间的差异用方差分析和成组t检验判断其统计学意义。
3结果
3．1照前灌胃褐藻糖胶对脾指数脾组织结构及内源性脾结节生成的影响7．5Gy照射小鼠的脾指数测定，各给药照射组相比照射对照组均显著增高(P＜0．05或P＜0．01，表1)，而给药照射组100mg·kg－1·d－1剂量效果最显著(P＜0．01);内源性CFU-S受到严重抑制，各给药照射组CFU-S的活存率均比照射对照组高，差异显著，并且随褐藻糖胶给药剂量的增大，CFU-S的活存率增高。取新鲜脾脏经4%甲醛固定、脱水、石蜡包埋、切片及HE染色［12］;脾及脾组织结构的改变:肉眼观察正常对照组脾脏明显大于照射对照组及中剂量照射对照组，中剂量照射组脾脏略大于照射对照组(图1)。电子显微镜观察脾脏的组织结构:正常对照组小鼠脾脏白髓淋巴细胞丰富，生发中心明显，红髓与白髓分界清晰(图2A);辐射对照组小鼠脾脏脾小体缩小，多大部分淋巴细胞核固缩、核碎裂，红髓、白髓分界不清，动脉周围淋巴鞘结构紊乱(图2B);褐藻糖胶中剂量照射组较照射对照组明显减轻，红髓、白髓分界模糊，但仍能分辨(图2C)。3．2照前灌胃褐藻糖胶对小鼠骨髓有核细胞数的影响6．0Gy照射小鼠的骨髓有核细胞数测定，小鼠骨髓有核细胞数照射对照组较正常对照组相比显著降低(P＜0．01)，各给药照射组相比照射对照组均有显著增多(P＜0．05或P＜0．01)，以给药照射组中剂量效果最显著(P＜0．01)，说明褐藻糖胶能显著促进60Co-γ辐射损伤小鼠造血机能的恢复，结果见表2。3．3照前灌胃褐藻糖胶对小鼠外周血细胞的影响5．5Gy照射后30d测定外周血象，其中WBC最敏感，照射后1d数量急剧减少，第3天降至最低点，PLT、ＲBC、HGB分别在7、14d降到最低点;辐照后1d及3d，褐藻糖胶低、中、高剂量组小鼠外周血WBC显著高于辐照对照组组(P＜0．05或P＜0．01)，此后各剂量组回升速度均显著高于辐照对照组组(P＜0．05或P＜0．01)，至30d，褐藻糖胶低、中、高剂量组WBC数量分别恢复至正常水平的77．07%、86．36%、75．10%，而辐照对照组的WBC数量仅回升至正常水平的69．11%;表明照前灌胃褐藻糖胶能对60Co-γ辐射引起的白细胞减少有显著的拮抗和促进恢复作用。辐照后各剂量组小鼠外周血ＲBC、PLT、HGB和照射对照组差异不显著(P＞0．05)，说明照前灌胃褐藻糖胶对60Co-γ辐射所致造血系统损伤的小鼠外周血ＲBC、HGB和PLT无明显影响，结果见图3。
4讨论
辐射后机体各个系统、器官、组织都有可能受到不同程度损害，尤其对于更新活跃、增殖旺盛的造血系统常造成较为严重的损伤。由于造血系统受到辐射后损伤早而重，其辐射修复能力却相对较弱，而造血系统又承担着机体适应防御、维持机体生命活动的重要功能。因此，电离辐射后WBC和PLT数会大量减少，免疫功能降低，从而诱发感染、贫血、出血等并发症［13-14］。电离辐射对机体损伤的主要机理之一与其产生的自由基有关，电离辐射通过直接和间接作用使生物大分子形成自由基，导致生物大分子化学键不稳定，甚至断裂。机体受照射后，外周血细胞几乎都经历这样一个过程:初期迅速下降，极期降到最低值，恢复期则逐步恢复，有时甚至会出现超过正常值。其中淋巴细胞的辐射敏感性最强。照后数小时，淋巴细胞绝对值就出现下降，到极期，外周血淋巴细胞甚至可以降至零。外周血淋巴细胞变化的严重程度和照射剂量呈正相关，照后早期淋巴细胞绝对数的变化被作为初期判断机体受照剂量的一个重要实验室指标。ＲBC数、HGB含量、ＲBC数压积等在机体受照射也会出现剂量依赖性下降，下降往往发生在照后稍长的一段时间。本课题研究发现小鼠在受60Co-γ射线照射前给予褐藻糖胶，能够有效抑制60Co-γ射线辐射损伤小鼠脾和脾脏指数下降、骨髓有核细胞数、造血干细胞、外周血WBC数量的减少并促进其数量的恢复，但对外周血ＲBC、PLT数及HGB含量无显著影响，这也可能与观察时间不够长有关。褐藻糖胶的抗辐射作用机制可能是通过直接吸收照射后产生的大量自由基作用外，还可能通过提高体内的抗氧化酶活性，抑制细胞凋亡，调节和增强细胞免疫功能来提高细胞对辐射的抵抗，促进造血和免疫细胞增殖和生长，使辐射损伤组织得到恢复。
作者：陈乾 晋进 郭宏举 马天翔 吴久鸿 单位：新安贞医院管理有限公司
