1虎杖茎尖对潮霉素的敏感性
本研究以潮霉素作为筛选标记，为有效筛选抗性苗，将制备的茎尖分别置于不同浓度梯度的潮霉素培养基上进行筛选，观察外植体的色泽变化、生长状态和存活情况，试验结果见表1和图1。从表1和图1结果可以看出，对照组的虎杖茎尖生长迅速，并分化出绿色的芽，芽的存活率为95.6%；随着潮霉素浓度的增高外植体生长减缓，分化出的芽弱小且存活率逐渐降低至23.7%；高浓度潮霉素处理造成植物组织失绿褐化并迅速死亡。当潮霉素浓度在4mg/L以下不能有效抑制非转化细胞的生长，容易造成大量非转化体的逃逸；潮霉素浓度在15mg/L以上时，外植体迅速死亡将影响转化细胞的正常生长；而潮霉素浓度8mg/L处理既能有效抑制非转化组织的生长，又不至于造成细胞迅速死亡，所以潮霉素浓度8mg/L是茎尖转化外植体筛选的适宜浓度。
2预培养时间对转化的影响
将虎杖茎尖分别预培养1、2、4和8d，侵染菌液浓度OD600值约0.4，侵染茎尖10min，共培养3d，统计转化后获得的抗性芽百分率及增殖系数见表2。结果表明，适当的预培养可以提高茎尖的再生分化率。预培养1d时的再生分化率较低（2.3%），再生芽生长细弱，不利于潮霉素抗性苗的获得；预培养2d的茎尖再生分化率最高（4.7%），再生芽生长健壮；预培养8d时的再生分化率反而下降（2.4%）。所以选择2d作为预培养的时间。
3菌液浓度对虎杖遗传转化的影响
将农杆菌的浓度OD600稀释为0.2、0.4、0.6和0.8，侵染预培养2d的茎尖10min，共培养3d，以转化后获得的抗性芽百分率及增殖系数作为评价指标（表3）。本研究中不同的菌液侵染浓度对侵染效果的影响显著。菌液侵染浓度OD600在0.2时分化率只有2.4%，浓度为0.6时的分化率达5.5%，之后随着浓度的增高分化率降低。故将农杆菌菌液浓度稀释至0.6进行侵染。
4侵染时间对虎杖遗传转化的影响
分别侵染预培养2d的茎尖5、10、15、20和25min，菌液浓度OD600约0.6，共培养3d，以转化后获得的抗性芽百分率及增殖系数作为评价指标（表4）。经10min侵染后的分化率与其他侵染处理都有显著差异，侵染5、20和25min之间的差异不显著。侵染10min的再生分化率达5.3%，增殖系数较高且再生芽强壮，故将侵染时间选择在10min。
5共培养时间对虎杖遗传转化的影响
用OD600值约0.6的菌液侵染预培养2d的茎尖10min，分别于黑暗中共培养2、3、4和5d，以转化后获得的抗性芽百分率及增殖系数作为评价指标（表5）。不同共培养时间对侵染结果的影响差异较大，2d时分化率较低（2.4%），经3d共培养后分化率可达5.6%，但是共培养5d后的分化率又降到2.9%。本试验条件下选择在侵染后共培养3d较为适宜，有利于获得较多生长健壮的抗性再生芽。
6虎杖转化苗的获得
虎杖茎尖遗传转化各阶段如图2所示。剥离好的茎尖经预培养后（图2-A），进行农杆菌侵染，并共培养3d（图2-B）；然后转移到筛选培养基上筛选（图2-C），不具潮霉素抗性的茎尖逐渐褐化死亡；将经筛选后成活的茎尖转移到增殖培养基上（图2-D），促进芽增殖与伸长；待幼苗生长至3-5cm高，转至根诱导培养基进行生根（图2-E）；最后移栽到盆土中生长（图2-F）。
7转基因虎杖的PCR检测
按照上述遗传转化体系，剥取虎杖茎尖300个，经农杆菌侵染转化、筛选，获得了移栽成活的抗性植株共15株，潮霉素基因的PCR检测（图3）显示其中6株为转基因的阳性植株，这些转基因植株均含有预期的约500bp的DNA片段。
8转基因虎杖的Southern杂交
选取PCR鉴定为阳性的转基因虎杖植株，提取叶片基因组DNA，经EcoRI酶切、电泳、转膜后以潮霉素基因为杂交探针的Southern杂交结果（图4）表明，在这6个株系中均检测到杂交条带，而野生虎杖没有杂交信号。因此，这些转基因虎杖株系的基因组中确实整合了目的基因。
9讨论
本试验前期采用叶盘法和愈伤组织侵染方法进行转化遇到诸多困难：叶盘经过不同激素组合诱导，较难诱导产生不定芽；虎杖是含酚类物质较高的药用植物，其愈伤组织易褐化、难分化成苗。而植物茎尖具有变异性小、有利于保持原有材料的优良性状等特点，国内外很多学者利用茎尖或茎尖分生组织获得了转基因植株［9-13］。因此，本试验选择茎尖为转化受体，探讨了影响虎杖茎尖遗传转化的主要因素。潮霉素的毒性机理是干扰植物细胞叶绿体和线粒体中的核糖体与延长因子EF-2的结合，从而抑制肽链的延长。潮霉素浓度过低易造成假阳性率过高；潮霉素浓度过高，可能导致不能得到足量的转基因植株。在对植物材料进行基因转化之前，对受体材料进行潮霉素敏感性试验是十分必要的。段晓昱等［15］的研究表明向日葵茎尖、子叶、胚轴不同部位转化外植体对潮霉素敏感性存在一定的差异；大豆品种黑农35的子叶节分化的潮霉素筛选浓度为6mg/L，而丛生芽生根的潮霉素筛选浓度降低为2mg/L［16］；可见对于同一种植物，不同的外植体对抗生素的敏感性也是不同的。本研究通过虎杖茎尖对潮霉素的敏感性试验，确定了虎杖茎尖转化的适宜浓度为8mg/L。在连续筛选过程中一直使用同一浓度进行筛选，这可能是造成转化率低的原因之一。在后续的研究中可以考察虎杖不同部位外植体对潮霉素的敏感性，采用梯度添加筛选剂的方式来提高转化率。在植物遗传转化中，预培养可以促进细胞分裂，处于分裂状态的细胞更易整合外源DNA，从而提高转化率；另一方面预培养能减少褐化现象的产生［17］。赵福永［18］对含酚类物质较高的棉花进行了预培养处理，根诱导阶段根诱导率要比对照组高15%左右。虎杖也是含酚类物质较高的植物，本试验中预培养2d是最佳处理，而预培养时间超过8d，转化率显著下降。转化率随着预培养时间的延长先增加后下降，在高粱茎尖转化中也有类似报道，其原因可能是预培养时间过短茎尖伤口未愈合易受农杆菌的侵害；预培养时间过长茎尖伤口细胞已不能提供足够的诱导农杆菌贴壁的受体，或由于茎尖分生组织细胞的分裂速度减缓，进入细胞核的T-DNA量减少［13］。王沛雅等［19］对河北杨的遗传转化研究表明，预培养2d以上可以显著提高转化率，但预培养2-8d间的差异不显著，转化率并不表现出随着预培养时间的延长先增加后下降的趋势，说明预培养的时间对转化率的影响可能与所选用植物材料等有关系。本试验成功建立了虎杖茎尖为转化受体、以潮霉素为筛选剂的根癌农杆菌介导的遗传转化体系，但虎杖茎尖的转化率远低于棉花［20］、小麦［9］等作物的茎尖转化效率，所以该遗传转化体系还有待优化。后续工作可以从农杆菌菌株、农杆菌介导法结合漩涡振荡、真空负压处理等方面来进一步优化该转化体系。本试验希望通过提高关键酶基因PcRS在虎杖中的表达水平，调控虎杖中白藜芦醇的生物合成。PCR和Southern杂交检测，表明外源基因已经整合到转基因植株的基因组中。但是本试验只进行EcoRI酶的单酶切，还不能准确确认外源基因插入的拷贝数和位点。在后续Southern杂交试验中可以采用多个限制性内切酶进行单酶切，或者采用双酶切。另外转基因植株的遗传稳定性、外源基因的表达、活性成分的含量变化等方面还需要进一步深入研究。
10结论
采用根癌农杆菌EHA105菌株侵染虎杖茎尖较适宜的转化系统为：预培养2d，农杆菌菌液浓度OD600为0.6，侵染10min，共培养3d，在筛选培养基中添加8mg/L潮霉素，待筛选获得的抗性芽生长至3-5cm高，再转至根诱导培养基使其长成完整植株。利用该体系成功实现虎杖茎尖遗传转化白藜芦醇合酶基因，本研究结果为拓宽虎杖遗传转化受体提供了技术和方法。
作者：柳忠玉 赵树进 单位：长江大学生命科学学院 广州军区广州总医院
