1蛋白质序列
蛋白质的氨基酸序列决定其结构和功能，因此氨基酸序列比对可以用来鉴定微生物和植物蛋白的生化和功能等同性。一般确定蛋白质的序列的方法为N端测序和串联质谱测序。微生物和植物目的蛋白的N端测序一般用Edman测序法［9］。目的蛋白通过和异硫氰酸苯酯作用转变为苯胺基硫甲酰蛋白，这种修饰了的N端氨基酸通过和三氟乙酸作用发生裂解后转变成可以在色谱分析或者电泳中分离识别的乙内酰苯硫脲。由于这种转化不可能反应完全，所以获得的序列数量有限。但是微生物蛋白中的前10个氨基酸残留序列可以检测出来，并能与获得的植物蛋白序列直接进行序列比对。Edman法得到的数据是半定量的，并且可以检测出混合样品中的N端形式。Edman化学降解测序法虽可靠、有效，但仍有其无法避免的局限性，如N端封闭的、环状的蛋白不能测定；被修饰的蛋白不能给出确切的信号；要求蛋白或多肽的纯度在95%以上；测序速度较慢，灵敏度较低，耗费大等。采用钠升喷雾（Nano）技术和碰撞诱导解离（CIDcollisioninducddissociation）方法，在电喷雾-四极杆-飞行时间质谱（ES1-Q-TOFelectrspectrometryionizationquadrupole-timeofflight）上，可以对两种序列部分未知的天然多肽进行从头测序（denovosequence）。例如，刘清萍等［10］利用钠升电喷雾串联质谱法对从Sigma公司购买的标准肽（GLU1）-FIBRINOPEPTIDEB（Glu-fib）进行了测序，采用钠喷针进样，TOFMS扫描，得到Glu-fib的（M+2H）2+的离子峰（图2），用Micromass的专用解谱软件MasSeq直接解析其序列为EGVNDNEEGFFAR，与Glu-fib的序列完全吻合。这种方法可以方便有效的解决传统的Edman降解法测序中常见的实际问题，如末位残基的丢失，赖氨酸和亮氨酸难鉴定等，此方法的建立是对Edman降解测序法很好地补充。
2糖基化修饰
植物中超过一半的蛋白质是糖基化形式。糖基化修饰能改变蛋白质的生理化学特性，如耐热性、功能活性、蛋白折叠、转运和半衰期等。在植物蛋白中N-糖基化是一种常见的糖基化形式［11，12］，一般为Asn-Xxx-Ser/Thr序列形式或较少见的Asn-Xxx-Cys序列形式（其中Xxx是除了Pro以外任意的氨基酸）。一般情况下，糖基化情况不同会导致蛋白生理化学性质的改变。在转基因植物中蛋白一般不会特异地进行糖基化，且大肠杆菌中表达的重组体蛋白也没有糖基化［13］。因此，如果能证明两种蛋白都不存在糖基化，也能证明两种蛋白在功能上具有等同性。典型的植物N-糖基化形式较复杂，并且每个糖基化基团增加1-2kD的质量［14］。通常检测植物蛋白糖基化基团的方法有：Westernblot免疫杂交分析、氨基酸序列分析、蛋白高效液相色谱分析、红外光谱（FT-IR）分析、电镜扫描图谱（SEM分析）等。图3就是一张从重组大肠杆菌和转基因玉米GA21叶片提取液中得到的mEPSPS蛋白的糖基化免疫杂交图［4］，结果证明两种mEPSPS蛋白都没有糖基化，因此通过Westernblot检测可以获得比较植物蛋白和微生物蛋白糖基化状态的证据。
3生物活性
3.1酶蛋白活性
许多转基因蛋白都是酶类，证明转基因蛋白和微生物蛋白的活性具有等同性非常重要。酶的活力用酶单位表示，一般经常用酶联免疫吸附试验（ELISA）来检测酶活力。但是，ELISA试验不能区别活性蛋白和非活性蛋白，从而使酶活力结果不准确。因此，为了提高检测的准确性，在分离纯化转基因植物表达蛋白时用原始的植物提取液来进行试验。另外，需要考虑的是植物样品中的蛋白酶和次级代谢产物，以及提取过程中pH的迅速改变等，这些因素都会影响酶的活力。在比较微生物和植物蛋白酶活力时，最好用原始的转基因植物提取液与混合了非转基因植物提取液的微生物蛋白进行研究。例如，草甘膦抑制5-烯醇式丙酮蟒草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS）的活性，这种酶可以催化莽草酸合成芳香族氨基酸过程。在转基因玉米GA21中表达一个经过改造的mEPSPS，其中由于两个氨基酸的替换，降低了草甘膦和mEPSPS的结合能力，从而产生草甘膦抗性［15］。微生物表达的mEPSPS蛋白酶活力是植物酶的9倍（表2）。然而，当微生物表达的酶和非转基因玉米提取液混合时，酶活力只是植物酶的2倍，表明玉米提取液抑制了mEPSPS的活性。这为利用微生物表达的mEPSPS是否适合代替植物表达的EPSPS来进行风险性研究提供了重要的信息。
3.2杀虫蛋白活性
杀虫蛋白的活性由一定时间内杀死给定试验幼虫的毒蛋白浓度或者剂量来衡量，一般由LC50来表示，即在一定时间内杀死暴露在毒蛋白中50%敏感幼虫的毒蛋白浓度。由于不同幼虫个体间会有些许不同，因此生物活性检测的结果也会不同。为了降低外来因素的干扰，植物和微生物杀虫蛋白的杀虫活力检测应当在统一的条件下进行，并且幼虫的来源也要统一，且随机分配到不同处理中。徐海滨等［5］证实大肠杆菌表达的Cry1Ie蛋白杀虫活性较强，与宋福平等［18］的试验结果大体一致（表3）；纯化Cry1Ie蛋白对玉米螟的生长抑制明显，与转cry1Ie玉米叶片所进行玉米螟虫试结果有良好的一致性，表明纯化Cry1Ie蛋白与转cry1Ie玉米表达的抗虫蛋白在生物活性上具有相似性。目前，大部分商业化的转基因作物以表达酶类或者毒素蛋白为主，检测这些蛋白活性的方法相对较简单，但转基因作物新的特性需要检测方法不断改进更新。例如，一种增加玉米水利用效率的方法是在玉米中表达一种来自于枯草芽胞杆菌的冷休克蛋白（CSPB），CSPB结合到单链DNA或RNA上，由于这种蛋白可打开DNA双链，其结合活性可通过一个标记的双链探针发射出的荧光检测［19］。这种方法已用来测定微生物和植物表达的CSPB蛋白的等同性。微生物蛋白与转基因植物蛋白等同性的确定是为了利用微生物蛋白进行转基因作物的风险性评估。例如，杨辉等［20］在进行转基因表达蛋白的急性毒性试验时，一般以啮齿类动物（通常是小鼠）一次性高浓度经口暴露，观察时间为14d，对于EPA和OECD，建议在急性经口毒性试验中采用的剂量分别为2000和5000mg/kg。显然，从转基因植物中获得如此高的纯化蛋白是不可能的，而当确定微生物蛋白和植物蛋白具有等同性之后，通过微生物表达蛋白就可以达到目的。本研究室与其他相关实验室合作，开展了微生物蛋白的纯化工作，通过构建Cry1Ie蛋白表达载体，在大肠杆菌表达菌株BL21中大量表达纯化Cry1Ie蛋白，以证明Cry1Ie蛋白在转基因玉米中的安全性，同时做好安全性评价工作。
4结语
随着现代生物技术的发展，转基因作物越来越多，利用微生物蛋白进行转基因作物风险性评估的有效性不仅取决于上述试验要素，更重要的是微生物蛋白必须能达到试验的目的。等同性并不意味着微生物蛋白和植物蛋白必须完全相同，而是在相关的特性上足够相似。但凡以微生物表达的蛋白代替转基因植物中的蛋白进行风险性研究需要符合以下的等同性鉴定标准：第一，两者在凝胶电泳中表现一致，即完整性；第二，具有相同的结合单克隆或者多克隆抗体的免疫反应活性；第三，具有相同的翻译后修饰特征（如糖基化）；第四，具有相似的氨基酸序列；第五，具有相似的生物学活性。但因蛋白功能上的变化、研究目的的不同以及评价者对蛋白间特殊差异选择的不同，很难确定出一套等同性的研究标准。因此，可以根据不同的试验目的设计试验来证明微生物蛋白是否适用于研究该转基因产品的风险性。随着生物技术的发展，相信会有更好的标准来鉴定微生物蛋白与转基因植物蛋白的等同性，以便利用微生物蛋白进行转基因作物的风险性评估。
作者：崔浩然 郎志宏 朱莉 汪海 黄大昉 单位：中国农业科学院生物技术研究所
