通过对不同植物转录因子NAP的功能进行分析，进而得出NAP与植物叶片衰老有密切的关系。Guo等[45]利用RNA杂交技术对AtNAP的时空表达进行了分析，结果表明，AtNAP在衰老叶片以及同一叶片衰老部分中的表达量较大。其后对野生型拟南芥植株进行T-DNA插入，进而得到AtNAP沉默的atnap突变体，发现atnap突变体植株衰老现象得到了明显的延缓，为了进一步说明AtNAP的功能，还做了回复突变atnap突变体，结果获得了表型与野生型株系相似的植株。NAP调控叶片衰老的功能近年来还在水稻、菜豆、竹子、番红花等植物中相继发现。Guo等[45]利用同源克隆技术在水稻以及菜豆中克隆了与AtNAP同源的OsNAP以及PvNAP两个转录因子，并且对这2个转录因子进行了功能性研究，表明这2个转录因子只在衰老的叶片中表达。Chen等[46]通过对竹子中的转录因子NAP进行同源克隆，获得了与NAP同源性很高的转录因子BeNAC1，并且对不同时期竹子的BeNAC1表达进行了分析，结果表明，其在衰老竹子的叶片中表达量最大，并且对其幼叶进行暗处理，也发现BeNAC1的表达随着暗处理时间的延长其表达量也相应的提高。同时将BeNAC1在拟南芥当中进行了异位表达，结果也证实了BeNAC1与叶片衰老有关。Kalivas等[49]对番红花中的CsatNAP在老叶与新叶中的表达量进行了检测，结果发现CsatNAP主要在番红花的老叶当中进行表达，而在新叶当中CsatNAP的表达量很低。
1在植物逆境胁迫中的调控作用
植物生活在复杂多变的环境中，经常会遇到高温、低温、盐碱胁迫、缺素胁迫、病虫害等不同的逆境胁迫，从而影响植物的生长发育，甚至导致植物的死亡。NAC转录因子对不同逆境胁迫有极大的响应作用[52]。Seki等[25]对拟南芥在干旱、冷害、以及盐胁迫条件下的基因芯片数据进行研究，发现其中NAC家族的成员在这些胁迫中表达上调，而NAP是NAC转录因子中一个重要的成员，因此，应该也会对植物逆境胁迫有不同的响应。Guo等[45]对拟南芥AtNAP的表达谱进行了分析与总结，发现除主要受到衰老调控外，还会受到一些诸如盐胁迫、缺氮胁迫、ABA等胁迫的调控。Balazadeh等[28]将生长两周的拟南芥浸入20mmol•L-1H2O2中，结果发现浸入1h后AtNAP的表达量显著上调，浸入5h后AtNAP表达量增加了18倍。Zhang等[53]将拟南芥叶片用ABA处理3h，随后检测AtNAP的表达量，结果发现，AtNAP表达量显著上调。Meng等[54]克隆得到棉花GhNAC转录因子，其中，GhNAC5属于NAP亚家族成员，分别对生长两周的棉花幼苗进行干旱、盐渍、低温以及ABA胁迫处理，发现对于GhNAC5而言其在低温、干旱、ABA胁迫时，表达量急剧上升，表明GhNAC5在调控棉花胁迫方面扮演着重要的角色。Huang等[50]随后在棉花中克隆到了另一个NAP亚家族的转录因子GhNAC8，发现主要受到ABA、低温、干旱和盐胁迫的调控。Peng等[47]在鹰嘴豆中克隆了NAP亚家族中的CarNAC3成员，该转录因子在干旱、ABA、乙烯以及IAA下表达量增加，但在6-BA下其表达量却降低。Li等[55]在小花蔓泽兰中分离到与NAP同源的MmNAP转录因子，发现其在机械损伤、ZnSO4、ABA以及SA处理后表达量都有不同程度地上升。Pinheiro等[56]研究了大豆中NAP亚家族GmNAC1的表达谱，发现GmNAC1主要受到衰老以及ABA调控。
2在改良作物品质中的应用
提高作物产量和改良作物品质一直是作物育种的重要目标之一。随着科技进步，分子育种为育种家们提供了一种新的思路和方法。Uauy等[57]利用图位克隆技术得到了一个与控制小麦籽粒蛋白含量、锌含量以及铁含量有关的Gpc-B1位点，该位点由一个具有多种功能NAP亚家族的NAM-B1发挥作用。在野生型小麦中NAM-B1的作用主要表现在加速植株衰老并且增加植株养分循环利用，但在栽培型小麦中则由于一个碱基的插入引起移码突变从而致使NAM-B1功能丧失，使其营养成分降低，但同时增强了小麦叶片的滞绿性。在栽培型小麦品种中通过RNA干扰技术，降低含有NAM结构域基因表达水平的转基因植株可以有效地延迟其衰老长达三周，并且籽粒中蛋白质、锌以及铁的含量下降超过30%。对于拥有巨大基因组的小麦而言，仅仅通过一个碱基的突变却改变了植株的衰老进程，进而导致其营养成分的改变确实让人为之震撼，同时也为作物育种提供了一种新的思路和方法。4转录因子NAP的调控机制转录因子NAP调控机制的研究目前主要集中在拟南芥中进行，同时如图2所示在其它植物中报道的NAP亚家族基因大多都与已经报道的拟南芥中NAP亚家族中的成员聚在一类，因此，利用拟南芥作为模式植物[58]，进行NAP相关调控机制的研究更容易得到其完整的调控原理，并有可能推广到其它植物中转录因子NAP相关调控机制的研究上。
2.1拟南芥NAP下游靶基因SAG113的发现与功能
2.1.1SAG113的发现与功能
众所周知，与幼叶相比，衰老叶片更容易失水，同时，ABA在促进叶片衰老这一过程中扮演着重要的角色[59]，但其原因却没有得到很好的解释。Zhang等[60]发现了与衰老有关的基因SAG113，很好地解释了这一现象。首先，检测了SAG113在拟南芥不同叶龄中的表达水平，发现其表达量多少与叶龄的大小成正相关性。为了更加准确地研究其表达谱，构建了PSAG113-GUS表达载体，发现GUS染色与叶龄的大小有关。随后用电子显微镜检测SAG113的表达部位，发现其主要在衰老叶片中保卫细胞处进行表达。随后对其结构进行了分析，发现其与ABA相关的转录因子ABI1有47%是相似的，因此，假定了其可能与ABA相关调控有关。然后用ABA分别诱导含有PSAG113-GUS载体的拟南芥幼叶0.5、1和3h，结果与预期相一致，即在诱导3h后SAG113在保卫细胞处进行表达。与此同时，利用抑制合成ABA的相关突变体aba2-1和abi4-1进行SAG113在不同叶龄中的表达分析，结果显示，在衰老叶片中其表达量显著降低。此外，研究也表明叶片中ABA的含量以及失水量与叶龄的大小成正相关，即叶龄越大，其叶片中ABA的含量就越高，进而叶片的失水速度也就越快。同时对SAG113的结构进行分析，发现SAG113具有明显的PP2C结构，并且进化分析结果表明其与拟南芥ABI1、ABI2以及酵母中PTC1蛋白具有很紧密的进化关系，同时将含有SAG113的PGL3216/TM126载体导入酵母PTC1缺失突变体中发现其部分恢复了PTC1的功能。随后利用GFP对SAG113进行亚细胞定位，结果表明，其主要在高尔基体处进行表达。对拟南芥SAG113进行过表达和抑制表达，并对其表型、总叶绿素含量、失水量以及其在ABA诱导下的气孔孔穴进行相关指标的测定，进一步验证了SAG113与叶片衰老有密切关系。以上研究结果表明SAG113丧失功能突变体表现出失水率低，并且在衰老过程中其气孔对ABA响应敏感，同时，与野生型植株相比，叶片衰老得到了适当的延迟；相反，SAG113过表达突变体则表现出完全相反的性状。这些研究结果表明在控制气孔运动方面，尤其是在衰老叶片中，SAG113可能是ABA调控的一个负调控元件。
2.1.2SAG113是转录因子
NAP的靶基因拟南芥NAP是NAC家族的一个重要成员，是一个在叶片衰老中起着重要作用的转录因子。SAG113是一个定位在高尔基体的PP2C家族成员，主要在衰老叶片中进行表达并与ABA调控的有关气孔运动和水分缺失有关，由于它们都与衰老有关，因此，可能存在一些内在联系，结果表明，SAG113是转录因子NAP的一个直接的靶基因。Zhang等[53]通过相关的研究发现，在衰老的拟南芥叶片中，AtNAP与SAG113都得以表达，同时在ABA的诱导下它们也都表达。为了检测转录因子AtNAP与SAG113的相互关系，将含有plasmid7001（含激活因子），与同时含有plasmid7001和plasmid1167（含AtNAP的CDS区，能被plasmid7001激活的启动子）的载体导入拟南芥幼叶中，结果发现，在DEX诱导下，AtNAP表达的同时SAG113也进行了相应的表达。然后又探究了在atnap缺失突变体中SAG113的表达情况，结果发现，在相同衰老程度的叶片中，SAG113在atnap缺失突变体中表达量较野生型植株下降80%左右，类似的结果也出现在ABA诱导下野生型和atnap缺失突变体中有关SAG113的表达水平上。以上研究结果充分证明了在ABA和衰老条件下SAG113与转录因子AtNAP的表达有很大的关系。为了进一步的证实SAG113是转录因子AtNAP的一个直接靶基因，即在转录水平上转录因子AtNAP特异性地结合SAG113的启动子从而使其表达，随即又做了相关的活体和离体检测试验。首先将SAG113启动子区域划分为不同的部分，克隆到含有LacZ报告基因的靶载体中形成许多报告载体，随后将AtNAP的编码区克隆到酵母中含有GAL4的载体中形成AD-AtNAP的目标蛋白。只有当酵母中同时含有AD-AtNAP和合适的靶载体时才能正确的表达AtNAP-GAD融合蛋白，同时GAD才能直接激活LacZ报告基因从而在缺少相关底物的条件下显示出蓝色。通过一系列的酵母杂交试验得出了AtNAP的靶基因的结合位点存在于a到e、h、i部位。通过对相关重叠区域进行分析，得出其结合位点位于从-216bp到-267bp之间52bp的区域。然后，又利用电泳迁移率变动分析（EMSA）技术对其AtNAP转录因子与SAG113启动子区52bp的相互关系进行了离体检测。来源于E.Coli的MBP-验AtNAP重组融合蛋白与带有32P标记的SAG113启动子上52bp的DNA片段相融合，通过电泳检测发现与对照相比该DNA-蛋白复合体电泳时的迁移速度变慢，随后将未标记的SAG113启动子上52bp的DNA片段与MBP-AtNAP重组融合蛋白放在一起，结果表明，这条带的含量明显减少，说明AtNAP特异性地结合52bp区域。接着又通过一系列EMSA试验在该融合蛋白中加入不同量未标记的SAG113启动子上36bp的DNA片段，结果发现，该区域为转录因子AtNAP的特异性结合位点的核心区域。随后利用EMSA技术继续对其36bp核心区域进行研究，分别构建每隔6个碱基进行碱基突变的未标记的DNA序列，结果发现，最后12bp即5′-GCACGTAAGTGT-3′为其相互作用所必须的区域。基于以上试验结果，分别对这12bp的碱基进行单碱基突变，发现了其最核心的9bp区域，即5′-CACGTAAGT-3′。因此把这个9bp的核心区域称为SAG113与AtNAP转录因子最核心的结合区域。以上结果表明SAG113是转录因子AtNAP的一个直接靶基因，过表达SAG113可以引起叶片衰老。为了更加充分地说明这一点，又将SAG113导入atnap突变体中进行回复突变，结果表明，导入SAG113后其衰老程度与野生型拟南芥相似，这也进一步证明了SAG113是转录因子AtNAP的一个直接靶基因。
2.2转录因子NAP与乙烯以及呼吸速率的相互关系
拟南芥NAP转录因子不仅与叶片衰老有关，也与果实衰老紧密相关。Kou等[61]对atnap缺失突变体与野生型植株的角果进行研究表明，atnap缺失突变体的角果衰老也被明显地延迟。野生型植株与atnap缺失突变体的第一个角果是同时出现的，但在生育后期，当野生型植株的第一个角果已经裂开时，atnap缺失突变体的第一个角果依然是完好无损。此时野生型植株的第四个角果已经出现衰老现象，然而atnap缺失突变体的第二个角果依然是绿色，未表现任何衰老表型。随后对这些角果进行分离，进而更加清晰地显示出角果的衰老程度，从角果的衰老进程可以明显地得出atnap缺失突变体角果的衰老速度显著迟缓于野生型角果。atnap缺失突变体和野生型植株角果的叶绿素a、叶绿素b以及总叶绿素的含量也与以上的结果相似。由于转录因子AtNAP与拟南芥角果衰老有很大的关系，为此研究了在果实衰老过程中AtNAP的表达情况。qRT-PCR分析表明，在野生型拟南芥中，AtNAP的转录水平随着角果的衰老而上升，但是AtNAP却未在atnap缺失突变体的角果中检测到。同时，野生型角果的乙烯释放率在10DPA之前一直保持上升，之后快速下降；而atnap缺失突变体角果的趋势类似，只是比野生型植株的角果延迟了2d左右，但在两种材料中乙烯释放率的最大值相似。就呼吸速率而言，野生型角果呼吸速率变化模式与乙烯释放率相似；但相比之下，atnap缺失突变体角果的呼吸速率在6DPA时达到最大值（约为野生型角果最大值的70%），之后在12DPA之前都保持稳定，之后其呼吸速率开始下降。这些数据均表明转录因子AtNAP在由乙烯引起呼吸峰的产生时起着一定的作用。由于外源乙烯通常会导致呼吸跃变型果实的呼吸峰提前，因此，研究了转录因子AtNAP对外源乙烯的响应。该研究对用10μl•L-1的外源乙烯处理野生型和atnap缺失突变体角果的呼吸模式进行分析，结果显示，外部施用乙烯刺激了野生型植株的呼吸，使得呼吸峰在8DPA的时候就出现了，比对照组快了2d。相比之下，同样的乙烯浓度处理atnap缺失突变体，其角果的呼吸模式影响却很小。这些数据再一次说明，转录因子AtNAP对由乙烯引起呼吸峰的产生起着一定作用。随后对施用外源乙烯处理过角果的乙烯释放量进行了测定，结果表明，外源乙烯同样刺激了野生型植株乙烯的合成，但对atnap缺失突变体的乙烯的合成影响较小。用外源ABA、SA、6-BA以及NAA处理两种类型角果，结果表明，未处理以及经过激素处理过的角果中，乙烯合成量在野生型植株中均高于突变型植株，但是对各种不同激素处理的响应却不尽相同。野生型角果的乙烯合成量在用6-BA、NAA和SA处理后有所下降，但是在用ABA处理后则上升（P＜0.05）。在突变型角果中，乙烯合成量在对照组、NAA组和ABA组都近似，但6-BA则引起了乙烯合成量的大幅降低。就呼吸速率而言，在ABA处理后，其在野生型角果中达到最高点，但其他情况下两种类型角果的呼吸速率差异不大。总体上，呼吸速率在NAA、6-BA和SA处理组中较低。通过对乙烯合成途径以及信号转导途径相关基因（AtACS2、AtETR1、AtCTR1、AtEIN2、AtERF1和AtEIN3）的检测，结果表明，在两种类型的角果中，AtACS2表达水平上升一段时间后开始有所下降，且其表达量在atnap缺失突变体中比野生型中更低。在衰老过程中，AtETR1在野生型角果中的转录水平的变化与AtACS2的表达模式非常相似；然而AtETR1在atnap缺失突变体的表达模式与AtACS2表达不同，即在突变型角果中，AtETR1的表达水平在6DPA和8DPA时期比同期的野生型角果的表达水平高。AtCTR1在两种类型角果中的表达模式与AtETR1表达模式相似。AtEIN2在突变型角果中的表达量较之于同期野生型角果的表达量降低。AtERF1在野生型角果中的表达模式与其他基因有所不同，其转录峰在8DPA的时候出现，大约比其它基因早两天。AtEIN3的表达则在野生型角果中12DPA之后急剧下调，但是在同期的atnap缺失突变体中表达量却增加。这些结果都表明转录因子AtNAP与呼吸速率以及与乙烯合成有密切的关系。
3展望
NAP是转录因子NAC家族中的重要成员，首先发现其为控制花发育AP3/PI的靶基因，因此，将其命名为NAP（NAC-Like，ActivatedbyAP3/PI）。自NAP在拟南芥中发现后，已相继在水稻、小麦、大豆、棉花、竹子、葡萄、番红花等植物中发现了与拟南芥NAP同源的NAP亚家族相关的转录因子，通过对已发现的NAP亚家族相关功能进行研究，发现其主要在调控植物生长发育、控制叶片衰老以及植物的逆境应答响应等方面扮演着重要的作用。转录因子NAP与植物的生长发育调控有关，尤其对于花器官的调控具有重要的作用。花作为重要的生殖器官，与农作物的产量和品质息息相关，当前对有关花器官生长发育的研究逐渐成为新的热点[62-64]。因此，可以利用转录因子NAP对不同植物花器官的发育进行深入研究，从而可以在理论上得出与花器官发育有关的若干个关键的调控基因，为今后进一步阐明花器官生长发育的相关代谢途径，为提高农作物的产量和品质服务。叶片衰老是细胞程序性死亡的一个重要阶段，叶片衰老时体内营养物质同时也进行着再循环再利用的过程[65-67]。NAP是近年来发现的与叶片衰老有关的转录因子，其在叶片衰老过程中表达上调，因此，可以在研究叶片衰老调控过程中利用NAP转录因子作为一个关键点，运用相关的生物技术分析其上下游基因，同时也可以与其他相关的调控叶片衰老有关的转录因子相联系，进而为阐明叶片衰老机制服务。与此同时，农作物的产量和品质也与光合作用有关[68]，而光合作用主要在植株的叶片中进行，所以研究NAP相关基因对叶片衰老的影响可以为提高农作物产量改善农作物品质提供新的思路和方法。植物生活在瞬息万变的环境中，再加上近年来地球常出现气温上升以及盐碱地、干旱等恶劣现象，使得植物不得不面对各种各样的生物以及非生物胁迫的危害。NAP亚家族作为NAC家族中的一个重要的成员，其在对外界胁迫响应方面具有重要的意义；可以利用NAP相关基因对植物应答外界胁迫反应进行研究，从而有助于提出相关的植物胁迫理论，进而为培育抗逆品种提供新的思路和方法。有关转录因子NAP调控机制的研究，通过最近几年的探索已经初步得知NAP的相关调控机制（图3），即在衰老叶片中NAP通过ABA-NAP-SAG113PP2C调节链，可以阻止野生型植株中叶片气孔关闭从而使足够的氧气可以渗入到组织中，使得乙烯释放进而使呼吸作用加快从而促进衰老；同时阻止气孔关闭也导致水分更快丧失也促进其叶片的衰老。而在atnap缺失突变体中，叶片对衰老信号敏感进而会促进气孔关闭，从而导致氧气吸入减少，呼吸作用下降同时也降低了水分的丧失，使衰老进程得以延缓。该模型可以得到以下事实的验证：（1）ABA会促进AtNAP以及SAG113的表达，同时通过酵母杂交试验以及EMSA技术可以得出SAG113是转录因子NAP的一个直接的靶基因。（2）SAG113主要是在气孔处进行表达，而且其与控制气孔运动有关，同时也与水分缺失有关。（3）ABA处理会促进野生型植株的呼吸作用（可能通过阻止气孔关闭使其叶片中可以获得更多的氧气并顺利进行呼吸作用），但是atnap缺失突变体的呼吸作用却没有明显的受影响。通过对现有的NAP调控机制的研究可以看出转录因子NAP与激素调控有着密切的关系，因此，今后可以由此作为突破口，对NAP调控机制进行相应的研究，进而为完善转录因子NAP网络调控机制服务。对NAP调控机制的研究不仅对理论研究有着重要的作用，同时对生产实践也有着较为更大的意义。通过对转录因子NAP调控机制的研究，可以进一步更加全面的了解这一代谢调控体系的关键节点，进而通过对其关键基因进行修饰，从而使植物在生育期内不早衰，尽量适当的延长其生育期，最终为提高农作物产量改善农作物品质服务。综上所述，NAP亚家族作为转录因子NAC家族中的一个重要成员，其在植物生长发育、叶片衰老以及逆境胁迫等方面有重要的作用，可以利用其功能，对植物的相关性状进行研究，为以后系统的理论研究和农作物的高产优质育种提供服务。
作者：范凯 王学德 袁淑娜 王铭 单位：浙江大学农业与生物技术学院
