1、Westernblot印迹法检测不同细胞中RECK蛋白的表达
按常规方法收集细胞，加入RIPA裂解液裂解细胞，应用分光光度计测定总蛋白浓度。配置SDS-PAGE凝胶，电泳条件90V、2h，电转仪电转300mA、1.5h、4℃。将硝酸纤维薄膜与适当稀释的一抗（1∶250）室温下反应2h，再与适当稀释（1∶50）的辣根过氧化物酶标记的二抗室温下反应1h，加入DAB底物溶液，显色5～10min，出现棕色带者为阳性。用自来水冲洗，以终止酶反应。1.5统计学分析各组均以x±s标准差表示数据，采用方差分析进行组间比较，应用SPSS11.0统计软件分析。
2、结果
RECKmRNA及MMP-2mRNA在正常卵巢上皮细胞及SKOV-3、A2780、HO-8910卵巢癌细胞株中的表达RT-PCR结果如图1所示，不同卵巢细胞株中均可见491bp的MMP-2和396bp的RECKmRNA扩增条带。表1显示RECKmRNA在正常卵巢上皮细胞的表达量明显高于在3种卵巢癌细胞株中的表达（P<0.01），3种卵巢癌细胞株中RECKmRNA的表达量没有明显差异（P>0.05）。与之相反，MMP-2mRNA的表达量在正常卵巢上皮细胞中明显低于在三种卵巢癌细胞株中的表达（P<0.01）。癌细胞与正常卵巢上皮细胞中RECK蛋白表达结果表1显示，正常卵巢上皮细胞与3种卵巢癌细胞株中RECK蛋白表达量有显著差异（P<0.01），而3种卵巢癌细胞株间表达量无明显差异（P>0.05）。图2显示为Westernblot检测RECK蛋白表达结果。
3、讨论
近年来研究发现，金属基质蛋白酶（MMPs）在细胞外基质降解、肿瘤侵袭和转移过程中发挥着重要作用。在侵袭和转移过程中，肿瘤细胞需要突破细胞外基质屏障，而各种细胞外基质成分的水解则依赖其特定的水解酶，因此整个细胞外基质的水解需要多种基质水解酶协同作用才能完成。MMPs具有水解不同类型的胶原蛋白、弹力蛋白等细胞外基质的能力，是由20多个锌依赖性内肽酶组成，其各成员在序列上具有高度同源性，以非活性的形式分泌，经过部分蛋白水解后变成活性形式。在正常稳定状态下，组织中MMPs的表达量极少，而在炎性细胞因子、激素、生长因子刺激和细胞转化过程中其表达量明显升高[1]。此过程涉及人体多种生理及病理过程，如炎症、胚胎发生、血管形成、肿瘤侵袭转移等。有研究表明，在肿瘤组织中，其多种MMPs的表达均明显升高，MMPs与多种肿瘤侵袭转移的能力呈明显正相关，与肿瘤患者的预后呈负相关[4]。因此，对MMPs及其抑制剂的研究也就成为了目前肿瘤侵袭转移研究的热点。RECK基因是1998年TakahashiC等[5]在v-Ki-ras转染的NIH3T3细胞中发现的一种新基因，定位于染色体9p13～p12，编码971个氨基酸，其编码的蛋白质相对分子质量为110KD。最初认为RECK是一个新的转化抑制基因，后来发现它能抑制MMPs的成员。RECK基因在正常组织中高表达，而在各种肿瘤来源的细胞系及转染了Ras等癌基因的细胞中不表达。许多癌基因如ras、fos、myc等均可以下调RECK基因的表达，这说明RECK基因可能是癌基因共同作用的一个负调节靶位点[6]。此外基因敲除发现，RECK基因还与血管生成密切相关，RECK基因的适量表达能抑制血管生成[7]。国外临床研究发现在肺癌、乳腺癌、胰腺癌、肝癌等组织中，RECK表达量与肿瘤组织的病理分期呈负相关，且RECK基因表达高的患者预后往往较好，因此认为RECK基因是一种抑癌基因，其抑癌机制可能与MMP的表达有关，其表达量可以作为判断患者预后的分子生物学指标[8-11]。但到目前为止，国内外尚未见卵巢癌中RECK基因的研究。本实验研究结果表明，在卵巢癌细胞株SKOV-3、A2780、HO-8910细胞中，RECKmRNA及RECK蛋白的表达量均较正常卵巢上皮细胞降低，而MMP-2mRNA的表达水平在三种癌细胞株中明显高于正常卵巢上皮细胞。本实验从细胞水平证明了RECK基因在卵巢癌中呈低表达，提示其是一种抑癌基因，且卵巢癌中MMP-2的高表达可能与RECK基因的低表达有关。研究已经证实MMPs高表达导致的ECM降解，为肿瘤侵袭及转移的必要条件。
所以本实验认为，在卵巢癌的发生过程中，RECK基因可能通过下调MMP-2起到抑癌基因的作用。RECK基因抑制MMP作用的具体机制尚不清楚。有学者认为RECK基因能在转录后水平抑制3种MMP，即MMP-2、MMP-9及MT1-MMP，进而抑制肿瘤的血管形成及转移；RECK蛋白也可抑制MMP-2前体蛋白的活化过程[3]。TakahashiC等研究发现将RECK基因转入HT1080纤维肉瘤细胞株后，其MMP-9前体及活性MMP-2的释放量明显降低[5]。MasuiT等研究则认为RECK蛋白可以通过抑制MMP-2的活性减少胰腺癌的侵袭[10]。迄今为止，关于RECK基因的研究刚刚开始，有许多问题尚待研究解决：如RECK的具体作用机制、其类似物或影响RECK表达的药物在肿瘤治疗中的作用等方面需要进一步的探讨；在分子水平，其三维结构、靶向特异性、RECK与这些靶目标之间的相互关系有待于深入阐明[3，11]；在细胞水平，RECK基因的调节机制、对于个体细胞中RECK的调节作用以及它们之间的相互作用均有待于进一步研究。相信随着以后对RECK的深入研究将有助于卵巢癌侵经济研究期刊号袭和转移的防治。
作者：瓮占平 王金会 纪向虹 陶红 单位：青岛市市立医院
