１材料与方法
１．１材料与试剂
实验细胞及药物：人胃癌细胞株ＳＧＣ－７９０１、雌二醇购自Ｓｉｇｍａ公司，货号Ｅ２７５８，用无水乙醇溶解。主要试剂：ＲＰＭＩ１６４０培养液、胰蛋白酶（含ＥＤＴＡ）、ＰＢＳ均购自杭州吉诺生物医药技术有限公司，胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司。ＣＣＫ８试剂盒购自日本Ｄｏｊｉｎｄｏ，Ｋｕｍａｍｏｔｏ公司。细胞周期试剂盒购自碧云天生物技术公司。ＴＲＩＺＯＬ购自美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司，逆转录试剂盒购自美国ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司。
１．２细胞培养和分组
人胃癌细胞株ＳＧＣ－７９０１（胃腺癌细胞）复苏细胞后，在３７℃、５％ＣＯ２条件下，培养于含１０％胎牛血清的ＲＰＭＩ１６４０中，传代至对数生长期进行实验。细胞分３组，即空白对照组、０．１μｍｏｌ／Ｌ组、１．０μｍｏｌ／Ｌ组，空白对照组给予含等体积无水乙醇的培养基，其余两组加含Ｅ２培养液，药物处理时改为含１％胎牛血清的培养液。给药２４小时后进行以下实验检测。
１．３ＣＣＫ８检测ＳＧＣ－７９０１细胞增殖
对数期生长的细胞按５×１０３个／孔的密度接种于９６孔板（１００μｌ／孔），于３７℃、５％ＣＯ２的恒温箱中培养２４小时后，按上述分组方法分别加入含有Ｅ２的培养液，各设置３个复孔，继续孵育２４小时后，向各孔加入ＣＣＫ８液１０μｌ，３７℃孵育１小时，在酶标仪４５０ｎｍ波长处测量各孔吸光度值。
１．４ＲＴ－ＰＣＲ检测ＳＧＣ－７９０１细胞雌激素受体的表达
对数期生长的细胞平铺于６孔板，按上述分组，药物作用２４小时后，用ＴＲＩＺＯＬ法提取总ＲＮＡ，按逆转录试剂盒说明书，ＰＣＲ仪扩增，逆转录成ｃＤＮＡ。反应条件：９４℃预变性４分钟；内参２０个循环，目的基因３０个循环，９４℃３０秒，５５℃３０秒，７２℃３０秒；７２℃５分钟。取３μｌＰＣＲ产物经２％非变性琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像获取图片经ＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅ软件分析。以相对表达量（目的条带与内参β－ａｃｔｉｎ灰度比值）反映ｍＲＮＡ表达水平。
１．５流式细胞术检测Ｅ２对胃癌细胞ＳＧＣ－７９０１周期的影响
取对数期生长的细胞用胰酶消化制成细胞悬液（浓度为５×１０５／ｍｌ），平铺于６孔板中，每孔加入２ｍｌ，置于３７℃、５％ＣＯ２孵箱中培养２４小时，去除培养基，按上述分组方法以Ｅ２处理，２４小时后消化收集细胞，预冷的ＰＢＳ洗涤２次，残留５０μｌＰＢＳ，轻轻弹击离心管底部适当分散细胞，加入1ｍｌ冰浴预冷的７０％乙醇轻轻吹打混匀，－２０℃冰箱固定过夜，离心去除固定液，预冷ＰＢＳ洗涤１次，加入５００μｌ配制好的碘化丙啶染色液３７℃避光温育３０分钟，３００目（孔径４０～５０μｍ）尼龙网过滤，ＢＤＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ流式细胞仪检测样品，ＢＤＭｏｄｆｉｔ软件分析周期分布。１．６统计学处理采用ＳＰＳＳ１７．０统计软件进行数据分析。结果用（珋ｘ±ｓ）表示，应用ｔ检验进行统计检验；单因素方差分析用于组间比较，Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。
２结果
２．１ＣＣＫ８法对胃癌细胞增殖活性的检测
由ＣＣＫ８法检测结果可知，雌二醇能够抑制人胃癌细胞的增殖，且当雌二醇浓度为１．０μｍｏｌ／Ｌ时，对ＳＧＣ－７９０１细胞的增殖有明显地抑制作用。随着浓度增加，雌二醇对ＳＧＣ－７９０１细胞的抑制作用逐渐增强，呈浓度依赖性，见图１。
２．２雌二醇对胃癌细胞周期的影响
流式细胞术结果显示，胃癌细胞ＳＧＣ－７９０１经雌二醇处理２４小时后，０．１μｍｏｌ／Ｌ组、１．０μｍｏｌ／Ｌ组Ｇ０／Ｇ１期比例较对照组增加，Ｇ２／Ｍ期和Ｓ期细胞比例较对照组减少。雌二醇可将细胞阻滞于Ｇ０／Ｇ１期，抑制细胞进入Ｇ２／Ｍ期和Ｓ期。
２．３ＲＴ－ＰＣＲ检测胃癌细胞雌激素受体的表达
雌激素受体包括ＥＲα和ＥＲβ，ＲＴ－ＰＣＲ结果示：两种雌激素受体相关基因ＥＲα和ＥＲβｍＲＮＡ均表达于胃癌细胞ＳＧＣ－７９０１，且随着雌二醇浓度的增加，受体相关基因ｍＲＮＡ表达水平未发现明显改变，见图３。
２．４数据库查询
通过Ｏｎｃｏｍｉｎｅ公共数据库查询雌激素受体ＥＲα在胃癌组织及非癌（癌旁）组织中的表达情况，发现ＥＲα在癌组织中的表达高于癌旁组织，图４左图数据来源于ＧＳＥ１３９１１［６］、图４右图数据来源于ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ－ｗｗｗ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｇａｓｔｒｉｃ＿ｃａｎｃｅｒ２／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌ［７］。
３讨论
一般认为肿瘤组织在形成过程中全部或部分保留激素受体，且生长受激素的影响，则生成的肿瘤为该激素依赖性肿瘤，对内分泌治疗有一定效果。反之，则为非激素依赖性肿瘤。大量的流行病学数据显示男性和女性之间的胃癌发病率之比为２∶１［２］，提示性激素水平可能与胃癌发病有关。目前关于雌激素与胃癌的研究有很多，但雌激素对胃癌细胞增殖、扩散和迁移的影响一直都饱受争议。Ｗａｎｇ及其同事却发现雌二醇经ＥＲα信号通路可刺激胃癌细胞的生长［８］。ＸｕＣＹ在其研究中显示ＥＲα（＋）和ＥＲβ（－）的胃癌患者较其他患者预后差［９］，雌二醇与ＥＲα３６结合后经ｃ－Ｓｒｃ信号通路可促进胃癌细胞的增殖扩散［１０］。相反，也有不少研究认为高水平的雌激素对胃癌的发生具有保护作用。Ｓｉｐｐｏｎｅｎ和他的同事证明女性形成胃癌的时间要比男性晚１０～１５年，且这种差异在更年期后降低［１１］。患有前列腺癌用雌激素替代治疗的患者胃癌发病率也会较未用雌激素替代治疗者降低［３］。当机体内雌激素浓度降低为１０－１０ｍｏｌ／Ｌ（相当于绝经后女性体内的雌激素浓度）时，可促进ＥＲα３６的表达和胃癌细胞的增长［１２］。在此我们主要探讨在体外雌二醇对胃癌细胞增殖的抑制作用。
雌激素通主要过其受体ＥＲα和ＥＲβ调控生长、发育和各种效应组织的功能。两种雌激素受体均为甾体激素核受体家族配体依赖性反式转录调节蛋白，ＥＲα主要分布于女性器官如乳房、子宫和卵巢，而ＥＲβ则分布于身体的范围较广［１３］。在本研究中，我们检测了雌激素受体在胃腺癌细胞中的表达，结果显示两种主要的雌激素受体ＥＲα和ＥＲβ均表达于胃腺癌细胞ＳＧＣ－７９０１。因此，雌二醇可通过其受体对胃癌细胞起作用。雌激素受体的表达对于雌二醇的信号转导相当重要，ＳｕｎＸＧ在其学术论文中提到胃癌标本ＥＲ的阳性率仅为３４％，癌旁组织阳性率６６．７％，其中对ＥＲ亚型没有分别统计［１４］。目前国内外关于雌激素受体在胃癌中的表达水平尚无定论。ＸｕＪＹ对胃癌雌激素受体在胃癌中表达意义的研究却发现胃癌组织ＥＲα、ＥＲβ的阳性率分别为３３．３％、７０．８％，癌旁组织ＥＲα为阴性、ＥＲβ阳性率为７２．９％［１５］。ＴａｋａｎｏＮ和ＷａｎｇＭ在其胃癌雌激素受体的检测中发现胃癌ＥＲα阳性率分别为５１％和４１．０３％，均远高于癌旁（３７％和２５．６４％）［１６－１７］。利用Ｏｎｃｏｍｉｎｅ公共数据库，我们也发现雌激素受体ＥＲα的表达显著高于癌旁组织。ＥＲα的表达增高会抑制胃癌细胞的增殖、浸润及转移［１８］。虽然ＥＲβ的表达阳性率较低，ＷａｎｇＭ等人的研究却发现其可能与抑制胃癌的增殖有关［１７］。肿瘤的发生学认为，细胞的恶性化转变与原癌基因激活过量表达和抑癌基因失活有关。雌二醇与受体结合后经ＥＲ信号通路可抑制ｃ－ｅｒｂＢ－２致癌基因和ｐ１８５的表达，而ｃ－ｅｒｂＢ－２和ｐ１８５的表达可促进胃癌的发生［１９］。本实验用ＣＣＫ８法检测雌二醇对胃癌细胞增殖活性的影响，结果提示雌二醇作用于胃癌细胞２４小时可显著抑制细胞活力，该抑制作用与雌二醇的浓度呈依赖关系。随着雌二醇浓度的增加，雌二醇对ＳＧＣ－７９０１细胞生长的抑制率逐渐加大，浓度１．０μｍｏｌ／Ｌ干预２４小时的抑制率最为显著。通过流式细胞术我们对各组细胞周期分布进行了分析，ＳＧＣ－７９０１细胞经不同浓度雌激素作用２４小时后的细胞周期时相可知，在０．１μｍｏｌ／Ｌ和１．０μｍｏｌ／Ｌ浓度的雌二醇作用下，各组细胞的Ｇ０／Ｇ１期细胞相比于对照组逐渐增多，其结果有统计学意义。同时，在１．０μｍｏｌ／Ｌ浓度的雌二醇作用下的Ｇ０／Ｇ１期细胞多于０．１μｍｏｌ／Ｌ浓度的雌二醇组，Ｓ期细胞则较之减少，其结果具有统计学意义。说明雌二醇对ＳＧＣ－７９０１细胞增殖周期有抑制作用，并使细胞阻滞在Ｇ０／Ｇ１期。这就和ＣＣＫ８法实验中的结论相一致，产生这一现象的原因可能是雌二醇阻滞细胞于Ｇ１期，影响细胞从Ｇ１期向Ｓ期发展，抑制了细胞的ＤＮＡ合成、复制，使Ｇ１期细胞增多，从而起到抑制细胞增殖的作用。细胞周期的调控是一个精细的生物学过程，涉及多个基因和蛋白的参与，形成了复杂的信号分子网络。细胞周期失控是细胞肿瘤化的一个重要原因，而细胞周期异常运转则是肿瘤细胞恶性增殖的核心环节，尤其Ｓ期的ＤＮＡ合成和Ｇ２／Ｍ期的细胞有丝分裂对肿瘤细胞的恶性增殖尤为重要。雌激素有可能对上述复杂途径中的某个环节产生了直接或间接的影响，最终导致临床上胃癌发生率的性别差异。
本研究结果显示，雌二醇能够显著抑制胃癌细胞的增殖，干扰其周期正常分布，对胃癌发病的性别差异做了初步的解释和探讨。但本研究中只用到一种细胞，我们的研究结果仅能为雌激素及其受体在胃癌发展的作用提供初步证据，雌二醇对胃癌ＳＧＣ－７９０１细胞周期阻滞的具体分子机制档案管理论文有待于进美国农业论文一步探讨。了解雌激素对胃癌细胞的直接作用机理不仅可以帮助解释性别导致的胃癌发生率的差异，也为胃癌的药物治疗提供了潜在的作用靶点，有利于药物佐剂的研发。
作者：李青云 秦健 郝亚荣 单位：武汉大学人民医院
