1类黄酮测定方法
（1）标准曲线的制备。采用NaNO2-2A（lNO3）3-2NaOH法测定类黄酮含量[5]。以芦丁作为标准品，绘制标准曲线，得到回归方程。（2）样品的处理。首先用1mol/L盐酸溶液分别调节各菌株发酵液pH值至3.0~3.5，置于60℃的水浴锅中加热酸化处理30min；随后在转速8000r/min条件下离心10min，分别收集离心上清液加入等体积30%乙醇萃取1h，萃取部分为类黄酮待测液。（3）类黄酮成分的测定。精确量取类黄酮待测液2.00mL置于10mL比色管中，加入30%乙醇补足至5mL；加入5%的NaNO20.30mL摇匀，静置5min；加入质量分数10%的Al（NO3）30.30mL摇匀，放置6min；加入4%的NaOH2.00mL摇匀，放置10min后，再加30%乙醇定容至刻度，静置10min，测定其在波长510nm处的吸光度，代入回归方程，计算样品中的类黄酮含量。
2分析
2.1紫外线辐射对链霉菌
HNS2-2的致死效应通过计算不同处理平板中的菌落数（CFU），根据所得原始数据和致死率的计算公式，得出紫外线辐射诱变处理时间与致死率的关系。由表1可知，致死率随辐射诱变处理时间递增，紫外线辐射80s时几乎全部死亡。
2.2紫外线辐射对链霉菌
HNS2-2的诱变效应以NaNO2-2A（lNO3）3-2NaOH法测定类黄酮含量为考核指标，对各处理组单个菌落进行摇瓶发酵初筛，并与出发菌株对照，统计初筛菌株的正变率，绘制紫外线照射时间与致死率、正突变率的关系曲线，各处理组的正变幅度均小于50%，诱变处理20s，致死率为80%时，菌株的正变率最大。紫外灯照射时间与正突变率的关系见图1。从初筛菌株中挑选出20株正变菌株进行摇瓶发酵反复复筛，得到菌株1423，243，251，4331的黄酮类物质的产量排前4位。紫外诱变对产量的影响见表2。黄酮类物质质量浓度分别为39.14，37.93，41.87，59.29μg/mL，均大于出发菌株的产量，说明通过紫外诱变能够增强放线菌产黄酮类物质的能力。
2.3高产菌株的遗传稳定性试验结果
经综合分析诱变对菌株产黄酮类物质能力的影响，以菌株1423，243，251，4331分别作为优势菌株进行遗传稳定性试验，连续传代（繁殖）7次后，分别取F1，F3，F5，F7菌株测定其黄酮类物质的含量。在设定第1代菌株的产量为100%的前提下，比较各代产量的百分率。高产突变菌株的遗传稳定性考察见表3，高产菌株251的遗传稳定性试验结果的方差分析和多重比较分析结果见表4。试验结果表明，菌株4331虽然第1代产量明显高于出发菌株，但是传代试验表明产量极不稳定。菌株251在传代7次后产量变化幅度小，且相对较稳定。对251菌株遗传稳定性试验进行进一步的统计分析。从表4可以看出，在传代试验中，每3代测1次黄酮类物质的产量，在因素分析中计算所得的F值为2.5201，查阅F值表，a=0.05的临界值F0.05（3,8）=4.07，F=2.5201<F0.05（7,16）=4.07。因此，结果表明该诱变高产菌株代间的黄酮类物质产量没有显著性差异，遗传性能稳定，保持了较高的正变幅度，同时证明了紫外诱变的有效性。
3结论及讨论
利用紫外线诱变处理能够有效提高产黄酮类化合物链霉菌野生菌株HNS2-2的生产性能。由于黄酮类化合物结构中具有酚羟基，可与铝离子在碱性溶液中显色，因此采用芦丁作为标准品，在加入铝离子试剂的条件下，控制好合适的pH值，黄酮类物质和铝盐形成配合物在可见光区能获得稳定的特征吸收峰，即通过黄酮类物质的特异颜色反应和分光光度法测定能快速测定诱变菌株代谢产物中黄酮类物质的含量，最终筛选出高产黄酮类化合物诱变株。在微生物发酵生产中，菌种的高产稳产是整个生产的关键，菌种选育尤为重要。今后可以采用复合因子诱变处理、基因工程育种等多种方法[6]进一步提高产物的产量，同时也可以对种子培养基、发酵培养基成分、发酵条件进一步优化，以期再次提高黄酮类物质的产量。
作者：李严军 廖杰琼 青文哲 陈力力 高必达 单位：湖南农业大学 食品科技学院 慈利县工商行政管理局 湖南省发酵食品技术开发中心 食品科学与生物技术湖南省重点实验室 湖南农业大学
