糖尿病是一种全身性代谢疾病，能诱发糖尿病脑病（diabeticencephalopathy，DE），出现学习记忆减退等脑功能受损的表现。文献及本课题组均发现，糖皮质激素增加是糖尿病学习记忆能力减退的重要原因，并从不同角度揭示了星形胶质细胞参与其中的机制但突触可塑性是学习记忆的神经生[1,2]，物学基础，星形胶质细胞间接影响学习记忆能力，神经元的状态直接决定了学习记忆功能。糖皮质激[3]素能直接调控神经元的结构和功能但糖尿病时糖[4]，皮质激素对神经元的影响及机制尚不完全清楚。因此，本研究拟探讨糖皮质激素对糖尿病大鼠脑海马区神经元的影响，为DE的治疗提供思路。
1材料和方法
1.1动物与实验试剂
雄性SD大鼠，体重200～220g（辽宁医学院实验动物中心），链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）及糖皮质激素受体阻断剂RU486（Sigma公司），Nissl染色试剂盒及Bax抗体（Abcam公司）。
1.2糖尿病大鼠模型的建立及实验分组
柠檬酸缓冲液配制浓度为2%的STZ溶液，SD大鼠禁食水12h后腹腔注射STZ溶液（给药量60mg/kg），48h后尾静脉血糖浓度大于16.7mmol/L为糖尿病大鼠模型。将RU486溶于生理盐水，参照文[2]献，糖尿病大鼠按照每日0.4g/kg的剂量给予RU486，即RU486组，对照组及糖尿病组仅给予生理盐水，每组8只大鼠，3个月后进行检测。
1.3水迷宫检测大鼠学习记忆能力
水迷宫定位航行实验检测大鼠学习能力，向水池中注水，使水面超过平台1cm，连续检测5天，每天4次，记录第5天大鼠从入水到登上平台所用时间，即逃避潜伏期。水迷宫实验第6天撤去水下平台，进行水迷宫空间探索实验，检测大鼠记忆能力，记录大鼠游泳速度及穿越原平台所在位置的次数。
1.4TUNEL染色
麻醉大鼠后，4%多聚甲醛灌注2h，制作厚度15μm脑海马组织冰冻切片，按试剂盒说明进行操作，TUNEL染色后，经1%克紫染色10min，梯度酒精脱水，氯酒分色，二甲苯透明，以中性树脂封片，倒置显微镜下观察，计数凋亡神经元数量。
1.5免疫组化染色检查海马区凋亡相关基因Bax蛋白表达
制作30μm脑海马组织冰冻切片，3%HO室温22孵育5min，10％正常山羊血清室温孵育1h。倾去血清，直接滴加兔抗大鼠Bax一抗（1:200稀释），4℃过夜后以生物素标记二抗（1:500稀释）孵育4h，DAB试剂盒显色，显微镜下观察并计数阳性神经元。
1.6Westernblot检测海马区Bax表达
大鼠麻醉后断头处死，剥离海马脑区，加入蛋白裂解液研磨。以12000rpm4℃离心15min，收集上清液，测定蛋白含量、水浴变性，调节各样品蛋白浓度，150V电压电泳，将凝胶上的蛋白质电泳条带转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉4℃封闭过夜，再分别以Bax及β-actin一抗37℃孵育4h（稀释比例分别为1:1000及1:2000），再以1：4000的比例稀释辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1h，将增强化学发光试剂盒中的A液及B液两种试剂等体积混匀，孵育PVDF膜，显影，以β-actin为内对照观察Bax蛋白表达变化。数据以均数±标准差表示，采用单因素方差分析，LSD检验，<0.05具有统计学差异。
2结果
P2.1大鼠学习记忆能力检测结果
水迷宫测试结果显示，与对照组相比糖尿病组逃避潜伏期延长，穿越平台所在位置的次数明显减少（<0.01），RU486组逃避潜伏期及穿越平台位置的次数均无明显变化（>0.05），各组大鼠之间的游泳速度无明显差别（>0.05，表1）。
2.2海马区细胞凋亡检测结果
TUNEL染色呈棕褐色的为凋亡神经元。对照组海马区偶见TUNEL阳性神经元，糖尿病组TUNEL阳性神经元是对照组的4.2倍，较对照组明显增高（P＜0.01）。RU486组TUNEL阳性神经元较糖尿病组下降了72.3%，明显减少（＜0.01，图1，箭头所示）。
2.3Bax蛋白表达检测结果
免疫组化检测显示，对照组脑海马区可见少量淡染Bax阳性神经元，糖尿病组大鼠脑海马区见大量Bax深染的阳性神经元，是对照组的2.9倍，其数量明显增多（＜0.01）。RU486抑制了糖尿病大鼠凋亡基因Bax的蛋白表达，RU486组Bax阳性神经元较对照组数量下降了58.7%，明显减少（＜0.01，图2）。Westernblot检测显示，对照组、糖尿病组、R486组海马脑区Bax相对表达量分别为（20.1±1.5）%、（32.3±2.1）%、（21.7±1.7）%。与对照组相比，糖尿病组大鼠海马脑区Bax表达增加显著（＜0.01），RU486组无明显变化（＞0.05，图3）。
3讨论
糖尿病主要是由胰岛素分泌不足或（和）胰岛素抵抗所致，糖尿病发病年龄越小，患者学习记忆越容易受到损害，学习记忆能力的减退较视力下降或肾功能减退发生更早，但症状轻微，易被忽视。儿童患者在糖尿病发病2年后即可出现较为明显的学习[5]记忆功能障碍，学习成绩进步较慢，甚至下降等。成年患者与儿童患者有所不同，除了学习记忆能力下降之外，还表现为注意力分散，信息处理速度以及[6]操作技能下降等。此外，糖尿病作为独立的危险因素，能加速老年患者的认知功能减退，增加患者老[7]年痴呆的风险。糖皮质激素对脑功能的调节较为复杂，糖皮质激素一过性升高能促进脑神经元再生，提高学习记[8]忆能力，但糖皮质激素长期增加时，却是脑功能异常的重要原因之一，阻断糖皮质激素受体能改善阿尔茨默脑病、精神分裂以及精神抑郁等患者的学习[9]记忆能力。本研究水迷宫实验中，大鼠游泳速度无组间差异，排除了运动功能对逃避潜伏期和穿越平台次数的影响。因此，本研究结果表明糖尿病组学习和记忆能力均下降，而糖尿病大鼠给予RU486后（即RU486组）学习记忆能力较对照组无明显变化。这提示糖皮质激素升高是糖尿病大鼠学习记忆功能减退的重要原因之一。[10]脑海马区是学习记忆的重要整合中枢，TUNEL染色显示，糖尿病组海马区神经元凋亡数目增加，RU486组大鼠海马区神经元凋亡数目减少，该结果表明糖皮质激素诱导海马区神经元凋亡是糖尿病大鼠学习记忆能力减退的重要原因。线粒体途径是神[11]经元凋亡的主要途径，Bax是细胞线粒体途径凋亡的重要因子，Bax表达上调参与了多种细胞凋亡的发生，其表达受糖皮质激素调节。糖皮质激素能上调[12]Bax表达，诱导胰岛β细胞凋亡，能上调Bax表[13]达，诱导胚胎细胞凋亡。本研究中，糖尿病组脑海马区神经元Bax阳性表达增加，RU486组海马区神PPP经元Bax表达减少，研究结果提示糖皮质激素促进了Bax在脑海马区神经元的表达，这可能是糖皮质激素诱导糖尿病大鼠海马区神经元凋亡的重要分子机制之一。本研究利用RU486揭示了糖皮质激素在糖尿病学习记忆功能下降中的作用，初步探讨了其中的细胞分子机制，为进一步阐明糖尿病脑病（diabeticencephalohathy，DE）发病机制奠定了基础，为DE的临床治疗提供了新思路。
作者：王大勇 左中夫 单位：辽宁医学院人体解剖学教研室
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