1材料与方法
1.1材料与仪器环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、双氟沙星、氧氟沙星、孔雀石绿标准品（纯度≥98.0%）和辣根过氧化物酶（HRP）美国Sigma公司；培氟沙星、沙拉沙星、氟甲喹和氯霉素标准品（纯度≥95.5%）德国Dr.Ehrenstorfer公司；抗环丙沙星单克隆抗体MAb-CIP和包被原CIP-OVA（本实验室制备）；包被液、PBS缓冲液、封闭液、TMB底物液和底物缓冲液等ELISA所需试剂均按文献[13]方法配制；辛酸、硫酸铵和过碘酸钠（分析纯）广州化学试剂厂；鱼虾类样品购于广州市内农贸市场；实验用水18.2mΩ.cm超纯水，其它试剂均为分析纯。VersaMax酶标仪和MultiWashⅢ洗板机美国MolecularDevices公司；API3000三重四级杆液质联用仪美国应用生物系统公司；R210型旋转蒸发仪瑞士BUCHI公司；BiofugeStratos台式高速冷冻离心机美国Thermo公司。1.2实验方法1.2.1酶标抗体的制备采用过碘酸钠法[14]，将辣根过氧化物酶（HRP）与经过辛酸硫酸铵法纯化的抗环丙沙星单克隆抗体（MAb-CIP）偶联，制备酶标抗体MAb-CIP-HRP。1.2.2dcELISA检测步骤1.2.2.1包被用包被液将包被原CIP-OVA（稀释至合适浓度，每孔100μL添加到酶标板孔中，4℃放置过夜。1.2.2.2封闭用洗涤液洗涤2次，甩干后每孔加入封闭液120μL，37℃温箱中封闭3h，甩干孔中液体后置于37℃烘箱中烘干备用。1.2.2.3加样用PBS缓冲液将药物标准品稀释成系列浓度，将酶标抗体MAb-CIP-HRP稀释3000倍，每孔加入药物标准液（或待测样品）和酶标抗体各50μL，轻摇混合，37℃温箱中孵育反应40min后洗涤液洗涤5次，甩干。1.2.2.4显色与测定将TMB底物液与底物缓冲液体积比1﹕1混合后，每孔100μL添加到板孔中，37℃温箱中显色10min后每孔加入50μL终止液终止显色反应，酶标仪测定其在450nm处的吸光度（A450nm）。1.2.2.5数据分析以药物标准液浓度的对数值为横坐标，以B/B0（B为添加药物时的吸光值，B0为不添加药物时的吸光值）为纵坐标，使用OriginPro7.5软件四参数对数函数进行曲线拟合，绘制对应的竞争标准曲线，计算获得dcELISA的最低检测限（LOD，IC10），半抑制浓度（IC50）、线性检测范围（IC20～IC80）等参数[13]。1.2.3样品提取与净化鱼类样品去鳞、去皮，沿背脊取肌肉；虾去头、去壳，取肌肉部分。样品均质处理成肉糜状的待测试样。准确称取试样5.0g，置于50mL聚苯乙烯离心管中，加入20mL酸化乙腈（含1%的乙酸），均质处理1min，漩涡混合2min，超声波提取5min，以4000r/min离心5min，上清液转移至蒸发瓶中。残渣中加入15mL酸化乙腈，重复提取一次后合并两次提取液，于45℃下减压蒸干溶剂。用2mLPBS缓冲液和5mL正己烷充分复溶，漩涡混合2min后，弃去上层正己烷，用5mL正己烷重复上述操作一次。移取下层液体并用PBS缓冲液定容至10mL比色管中，取50μL直接用于dcELISA检测。
2结果与分析
2.1酶标抗体工作浓度的选择本研究采用过碘酸钠法将HRP表面的糖基氧化成醛基后与单抗MAb-CIP上的氨基进行偶联，制备酶标抗体Mab-CIP-HRP。采用直接ELISA法来确定Mab-CIP-HRP的工作浓度，将包被原CIP-OVA包被到酶标板上，加入酶标抗体孵育反应，洗涤后加入显色液，酶催化的显色液吸光度值与酶标抗体含量呈正比[14]。结果显示，在包被浓度为0.2μg/mL，Mab-CIP-HRP稀释度在1/3000时，A450nm在1.4左右，可以满足免疫分析法的检测要求。因此，本研究选择酶标抗体工作浓度为1/3000。2.2包被原浓度和竞争反应时间的确定包被原浓度和竞争反应时间对ELISA的灵敏度有显著影响，本研究通过单因素实验对其进行优化，绘制不同反应条件下环丙沙星的竞争标准曲线，以Amax/IC50为参考标准评价曲线性能，其中Amax为对应曲线的最大吸光值，比值越大则代表灵敏度越高，重复性越好[15]。由图1（a）所示，随着包被原浓度的增加Amax逐渐增加，在最大包被浓度时IC50显著升高，说明包被浓度过高时与酶标抗体亲和力强，不利于游离的小分子药物竞争反应，降低检测灵敏度。在包被原浓度为0.2μg/mL时曲线的Amax/IC50最大，因此选择包被原浓度为0.2μg/mL。同理，由图1（b）所示，随着反应时间的增加，Amax趋于平衡，IC50变化不大，反应时间为40min时曲线的Amax/IC50最大，因此选择40min为dcELISA竞争反应时间。2.3有机溶剂甲醇和乙腈对反应的影响有机溶剂会干扰免疫分析中抗原抗体的结合[16]，因此本研究选用两种试验中常用的水溶性有机溶剂甲醇和乙腈，考察其在缓冲体系中的含量对所建立的dcELISA灵敏度的影响。结果如图2所示，当缓冲液中甲醇含量低于5%时，对dcELISA的灵敏度没有显著的影响，进一步甲醇含量增加至10%时，曲线Amax和IC50均有小幅度的升高。而随着缓冲液乙腈含量的增加，曲线Amax不断下降，IC50不断升高，灵敏度显著降低。因此，所建立的dcELISA的缓冲体系中可以耐受5%的甲醇含量，但乙腈含量则需严格控制。2.4方法特异性分析基于前述最优的实验条件参数，进行标准曲线的绘制。图3是经OriginPro7.5软件四参数对数函数拟合后环丙沙星的dcELISA标准曲线，拟合度良好并呈典型的S型曲线，IC50为2.1ng/mL。同时，在最优的反应条件下，绘制不同药物的竞争标准曲线，以交叉反应率（CR）评价方法的特异性，结果按式（1）计算：CR(%)=［IC50(环丙沙星)/IC50(其它药物)］×100%式（1）交叉反应研究使用了8种结构相似的FQs类药物和2种水产品养殖过程中常见的抗菌类药物（氯霉素和孔雀石绿）。结果如表1所示，dcELISA针对环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、培氟沙星、沙拉沙星和双氟沙星的交叉反应率均超过了65%，表明本方法具有宽谱特异性。结果同时显示dcELISA针对上述6种高交叉反应的FQs类药物的LOD均不超过0.5ng/mL，线性范围（IC20~IC80）在1.0~12.1ng/mL之间，满足国标GB/T20366-2006和农业部235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》的相关检测要求，可用于这6种FQs类药物多残留检测。2.5样品添加回收测定选择对虾、鳗鲡和鲫鱼三种水产品进行样品添加回收试验。向样品中分别添加5.0、10.0和20μg/kg三个水平的FQs类药物标准液，室温下放置过夜后用1.2.5方法处理，计算各水平的回收率和相对标准偏差（RSD）。结果如表2所示，dcELISA检测6种FQs类药物在三种水产样品的加标回收率为70.4%～104.1%，RSD为5.0%～14.7%，表明本方法准确度和灵敏度良好，满足水产样品中6种FQs类药物残留痕量检测的要求。2.6HPLC-MS/MS比对检测随机从农贸市场抽取鱼虾类水产样品，将样品平均分成两组，一组按照1.2.3方法处理后用于dcELISA检测（结果以环丙沙星含量来表示），另一组用HPLC-MS/MS进行检测，样品处理方法和仪器参数设置参照GB/T20366-2006，其中HPLC-MS/MS采用多反应监测（MRM）模式。图4是6种FQs类药物混合标准溶液的MRM离子流色谱图（10ng/mL）。比对检测结果显示，随机抽取了15份水产样品，其中dcELISA和HPLC-MS/MS针对一份鲫鱼样品检测出环丙沙星含量分别为8.3μg/kg和7.6μg/kg，其余14份样品检测结果均为阴性，表明两种方法结果相关度高，结果准确可靠。
3结论
针对具有广谱性抗菌作用氟喹诺酮类药物的残留监测，快速准确的多残留免疫分析法是一种有效的筛选手段。通过免疫分析法对样品进行初步筛查，进一步通过色谱仪器分析法对阳性样品含量进行确证分析，有效提高了检测工作的效率和准确度，近年来已逐步成为农兽药残留检测的主要研究方向。本研究建立了检测水产品中6种FQs类药物残留的dcELISA方法，方法灵敏度高，满足相关限量标准的检测要求，在三种水产品中的加标回收率为70.4%～104.1%，相对标准偏差为5.0%～14.7%，与HPLC-MS/MS具有良好的相关性，结果准确可靠，可用于水产品中氟喹诺酮类药物多残留快速测定。
作者：王强 王旭峰 杨金兰 陈培基 杨宏亮 黎智广 李刘冬 单位：中国水产科学研究院南海水产研究所 农业部水产品加工重点实验室 农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室
