［摘要］目的：探讨茵陈色原酮（capillarisin，Cap）对结肠癌细胞增殖及迁移能力的影响及其机制。方法：采用不同浓度的Cap体外干预结肠癌细胞SW620及正常结肠细胞FHC，CCK-8比色法检测细胞增殖活性，Transwell迁移实验检测细胞迁移能力，实时定量PCR（qPCR）法检测癌基因（K-ras、c-Src、c-Myc）的mRNA表达，Westernblot检测细胞上皮－间质转化（EMT）标志蛋白（E-cadherin、Vimentin）表达。结果：与DMSO对照组相比，各组Cap可显著抑制结肠癌细胞SW620增殖活性及迁移细胞数（P＜0．05），但对正常结肠细胞FHC增殖及迁移作用无显著差异（P＞0．05）；与5-FU组相比，各组Cap对于正常结肠细胞FHC的增殖及迁移活性抑制作用显著减小（P＜0．05）。与DMSO对照组相比，各组Cap可显著降低结肠癌细胞K-ras、c-Src、c-Myc的mRNA水平。与DMSO对照组相比，Cap高剂量组可提高结肠癌细胞上皮标志物E-cadherin蛋白表达，降低间质标志物Vimentin蛋白表达。结论：Cap可能通过抑制癌基因（K-ras、c-Src、c-Myc）mRNA表达抑制结肠癌细胞增殖，通过逆转EMT过程抑制结肠癌细胞转移。与5-FU相比，Cap可能具有更好的应用安全性，具有开发为新一代天然抗肿瘤单体药物的前景。
［关键词］茵陈色原酮；结肠癌；增殖；转移；上皮－间质转化
结直肠癌（colorectalcancer，CRC）是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，发病率呈逐年上升趋势，全球每年约120万新发病例，其病死率约为20．51％［1］。近年来我国结直肠癌的发病率和病死率增长迅速，每年新发病例高达17万例，患病率达46．8／10万［2］。近来研究发现，茵陈蒿的活性成分之一茵陈色原酮（capillarisin，Cap）可抑制多发性骨髓瘤细胞抗凋亡基因、细胞迁移及血管生成相关基因表达［3］，表明Cap具有一定的抗肿瘤应用前景。但Cap对于结肠癌等消化系肿瘤的作用及其机制尚未见报道。本研究将探讨Cap对结肠癌细胞体外增殖活性及迁移能力的影响及其机制。
1材料和方法
1．1材料
结直肠癌细胞株SW620、人正常结直肠黏膜细胞FHC（ATCCCRL1831，广州吉妮欧生物科技有限公司）以含10％胎牛血清（Gibco公司，美国）、100U／mL青霉素、0．1mg／mL链霉素的低糖DMEM培养基（Hyclone公司，美国）复苏培养，在37℃、5％CO2、饱和湿度条件下孵育。细胞在对数生长期以0．25％胰蛋白酶液（Sigma公司，美国）消化传代，以培养基稀释至适当浓度备用。细胞分组：CaP标准品（CAS：56365－38－9，Pureonebio，HPLC检测纯度＞98％）以DMSO溶解，以培养基调整终浓度分别为50μmol／L（低剂量，Cap-L）、100μmol／L（中剂量，Cap-M）、200μmol／L（高剂量，Cap-H），分别以10μL加入相应96孔细胞培养板（Corning公司，美国）干预细胞。正常对照组每孔加入10μL0．05％DMSO，阳性对照组每孔加入10μL50μmol／L5－氟尿嘧啶（5-FU，上海旭东海普药业有限公司，批准文号：国药准字H31020593）。
1．2方法
1．2．1CCK-8比色法检测各组细胞活性上述各组细胞株以培养基分别稀释至浓度5×104个／mL，分别取100μL至96孔培养板，上述每组细胞分别接种3个复孔。将培养板在培养箱分别孵育0、6、12、24h；每孔加入10μLCCK8溶液（同仁公司，日本）继续孵育2h；用酶标仪测定在450nm处的吸光度。绘制细胞生长曲线，计算细胞增殖抑制率（％）＝（1－实验组吸光度值均数／对照组吸光度值均数）×100％。1．2．2Transwell实验检测各组细胞迁移活性收集上述对数生长期的各组细胞，分别以5×105个／mL浓度，1mL／孔接种于12孔Transwell插入式培养皿（Corning公司，美国）上室，下室加入含20％FBS的细胞培养液，每组设2个复孔。分别干预24h后收集细胞，计算各孔迁移至Transwell下室的细胞数，计算平均值及标准误。上下室之间为聚碳酸酯微孔滤膜（孔径8μm）。培养18h除去未黏附细胞，固定染色，200倍光镜下计数。计算各组细胞迁移抑制率＝（对照组迁移细胞数－实验组迁移细胞数）／对照组迁移细胞数×100％。1．2．3qPCR法检测结肠癌细胞相关分子mRNA表达水平收集各组结肠癌细胞SW620，提取细胞RNA，采用逆转录试剂盒（Thermo公司，美国）反转录合成cDNA，β-actin为内参。采用real-timePCR检测仪（ABI-7300，美国）分别检测K-ras、c-Src、c-Myc的mRNA表达。RNA引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成：K-ras：上游引物5′-GGAAG-AAGGTGACTTAGGTT-3′，下游引物5′-GAC-TGGCACTGAAGATGG-3′；c-Src：上游引物5′-CAG-GCTGAGGAGTGGTAT-3′，下游引物5′-GCTTGCGG-ATCTTGTAGT-3′；c-Myc：上游引物5′-CAGAGGCAG-AGAAGAGATG-3′，下游引物5′-CACAGGAA-CACG-ATGACA-3′；β-actin：上游引物5′-TGACGTGGACAT-CCGCAAAG-3′，下游引物5′-CTGGAAGGTGGACAG-CGAGG-3′。采用SYBRGreenPCR试剂盒（Thermo公司，美国）进行qPCR反应，绘制标准曲线，72℃延伸阶段采集荧光。采用SDS2．3软件分析结果。采用比较Ct值法（2－△△Ct）计算样本中目的基因mRNA相对表达量。1．2．4Westernblot检测结肠癌细胞上述间质转化（epithelial-mesenchymaltransition，EMT）蛋白表达各组结肠癌细胞SW620以1×106个／mL浓度接种于2mL／孔DMEM培养液的6孔板，每组设2个复孔。收集细胞，加入RIPA裂解液提取总蛋白，Bradford法检测浓度。取50μg总蛋白上样电泳、转膜、封闭，分别加入EMT标志蛋白E-cadherin（Cat．3195，CST公司，美国）、Vimentin（Cat．5741，CST公司，美国）及内参基因GAPDH抗体（Cat．5174CST公司，美国）（稀释度均为1∶1000），膜接触过夜；洗膜，加羊抗兔HRP标记二抗（Cat．A0208，稀释度1∶1000，杭州碧云天公司），孵育，洗膜，加入ECL化学发光显示剂显影；图像分析软件扫描分析条带灰度值。目的蛋白表达相对强度＝目的条带灰度值／GAPDH条带灰度值，各扫取3个灰度值。
1．3统计学方法
运用统计软件SPSS19．0进行数据分析；计量数据以均数±标准差（x±s）表示；多组间计量资料比较用单因素方差分析；两两比较采用q检验，部分变量间的相互关系采用秩相关分析法；P≤0．05为差异有统计学意义。
2结果
2．1CCK-8比色法检测各组细胞活性
Cap各剂量组对结肠癌细胞SW620的增殖抑制率呈剂量及时间依赖性递增，在24h达最大增殖抑制率（Cap高、中、低剂量分别为16．99％、12．00％、7．32％）；与DMSO对照组相比，Cap高、中、低剂量均可显著抑制结肠癌细胞SW620增殖活性（P＜0．01，图1A）；Cap高、中、低剂量对于正常结肠细胞FHC的增殖抑制率在24h达最大分别为14．73％、9．84％、6．30％（图1B），与结肠癌细胞相比显著减小（P＜0．01）；与5-FU相比，各组Cap对于正常结肠细胞FHC的增殖抑制率显著减小（P＜0．01，图1B）。
2．2Transwell实验检测各组细胞迁移能力
高、中、低剂量Cap及5-FU对SW620细胞的迁移抑制率分别为44．47％、26．76％、10．65％、53．00％；与DMSO对照组相比，各剂量Cap干预后结肠癌细胞SW620的迁移数显著减少（P＜0．01，图2），各剂量Cap及5-FU对SW620细胞迁移数的影响无明显差异（P＞0．05）。高、中、低剂量Cap及5-FU对正常结肠细胞FHC的迁移抑制率分别为17．39％、11．01％、3．19％、64．35％；与DMSO对照组相比，各剂量Cap干预后结肠细胞FHC的迁移数无显著减少（P＞0．05），而5-FU干预显著减少结肠细胞FHC迁移数（P＜0．05）；与5-FU相比，高、中、低剂量Cap处理的FHC细胞迁移数具有显著差异（P＜0．01，P＜0．05，图2）。
2．3qPCR法检测结肠癌细胞癌基因mRNA表达水平
与DMSO对照组相比，Cap高剂量组可显著抑制结肠癌细胞SW620的K-ras、c-Src、c-MycmRNA表达（P＜0．01、P＜0．01、P＜0．05，图3）。
2．4Westernblot检测结肠癌细胞EMT蛋白表达
与DMSO对照组相比，高剂量Cap可提高结肠癌细胞SW620的E-cadherin蛋白表达，抑制Vi-mentin蛋白表达（P＜0．05，图4）；但各剂量组Cap对于正常结肠细胞FHC的E-cadherin蛋白及Vi-mentin蛋白表达无显著影响（P＞0．05，图5）。
3讨论
本研究采用Cap体外干预结肠癌细胞后，采用CCK-8比色法检测各组细胞活性，结果发现，与DMSO对照组相比，各组Cap可呈剂量依赖性抑制结肠癌细胞SW620增殖活性；与结肠癌细胞相比，各组Cap对于正常结肠细胞FHC的抑制作用显著减小，且显著低于5-FU，该结果显示Cap在具有较强的抗结肠癌细胞增殖活性的同时，对于正常结肠细胞增殖的抑制作用相对较小。为探讨Cap对于结肠癌转移的抑制作用，本研究采用Transwell迁移实验观察经Cap干预后结肠癌细胞SW620的迁移能力，发现高、中、低剂量组Cap均可显著减少结肠癌细胞迁移数，表明Cap具有抑制结肠癌细胞迁移的作用；而高、中、低剂量组Cap干预结肠细胞FHC的迁移数无显著减少，但5-FU显著抑制FHC迁移，表明Cap对正常结肠细胞的迁移活性的影响相对于5-FU较小。为验证Cap抗结肠癌细胞增殖活性是否与癌基因K-ras［4］、c-Src［5］、c-Myc［6］表达有关，本研究用Cap干预结肠癌细胞后，采用实时定量PCR法检测结肠癌细胞上述癌基因的mRNA表达，发现高剂量Cap可显著降低结肠癌细胞K-ras、c-Src、c-Myc的mRNA水平，表明Cap可能通过抑制癌基因K-ras、c-Src、c-Myc进而抑制结肠癌细胞增殖。EMT被认为是上皮来源肿瘤细胞获得侵袭和转移能力的重要生物学过程［7］。为了证实Cap抑制结肠癌细胞迁移能力是否与抑制EMT过程有关，采用Westernblot检测了Cap干预后的结肠癌细胞EMT上皮标志蛋白E-cadherin及间质标志蛋白Vi-mentin的表达，发现与DMSO对照组相比，Cap高剂量组可增加结肠癌细胞E-cadherin蛋白表达而降低Vimentin蛋白表达，表明Cap可能通过逆转EMT过程抑制结肠癌细胞迁移。综上所述，Cap可能通过抑制癌基因（K-ras、c-Src、c-Myc）mRNA表达从而抑制结肠癌细胞增殖，通过逆转EMT过程进而抑制结肠癌细胞转移。与5-FU相比，Cap可能具有更好的航空机电论文应用安全性，具有开发为新一代天然抗肿瘤单体药物的前景。
作者：张慧 崔戈 李阳 孙倩 蔡倩 张婷 柳金娜 冯馨园 钱乙 单位：湖州师范学院医学院病理学与病理生理学系 湖州师范学院附属第一医院病理科
