【摘要】目的通过体外实验研究探讨人食管癌细胞株的放射敏感性。方法培养并使用6MVX线照射人食管癌细胞株TE－10、kyse－150，应用集落形成实验测定两株癌细胞照射后的存活分数，计算其的放射生物学参数。结果食管癌细胞株TE－10对放射治疗较kyse－150敏感，SF2为0．388，而kyse－150的SF2为0．758。结论相对于kyse－150，食管癌细胞株TE－10的放射敏感性更高。
【关键词】食管肿瘤;细胞株;放射敏感性
食管癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，绝大多数病理为鳞癌，其发病率排国内肿瘤第四位。高达40%以上的食管癌发现时已失去手术机会、须以放疗为唯一根治性方法，再加上术后辅助治疗以放疗为主，因此放疗在食管癌治疗中占重要地位。然而，食管癌放疗后五年生存率仍徘徊在20～30%。因此，为提高放疗疗效，对食管癌患者放疗敏感性进行深入研究是有重要的临床价值。本研究使用集落形成实验，检测并比较食管癌细胞株TE－10、kyse－150的放射敏感性，以深入研究放疗的作用机理，最终为提高放疗疗效提供新思路。
一、材料与方法
1．细胞株培养条件:人食管癌细胞株TE－10、kyse－150，由苏州市立医院放疗科周俊东医生惠赠。细胞用ＲPMI1640培养基(含10%灭活胎牛血清)，置于37℃、5%二氧化碳孵箱中进行培养。观察细胞生长周期，当其处于指数生长期时进行照射。2．照射条件:使用医用Varian23EX直线加速器所产生的6MVX线对细胞进行照射，照射方式为自上至下照射，源皮距100cm，照射野20cm×20cm，照射时培养瓶正置，瓶上放置总厚度为1．5cm的“固体水”，剂量率200cGy/min。3．集落形成实验:处于指数生长期的细胞，用0．25%胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，在六孔板的单个孔中，分别接种800个细胞。轻轻晃动使细胞均匀分散，在37℃孵箱中培养过夜;细胞贴壁后给予照射。分别给予0、1、2、3、5、7、10Gy单剂量照射，每个剂量点设三个平行样品，计算时取均数。继续培养于37℃孵箱;待培养瓶中出现肉眼可见的集落后终止培养，甲醇固定，Giemsa染色镜下计数超过50个细胞的集落。计算集落形成率(PE):PE=集落数/接种细胞数×100%。以未经照射六孔板中的集落形成率作为100%，根据不同剂量照射下的集落形成率计算细胞存活率(SF):SF=照射组PE/对照组PE×100%。4．统计学方法:数据采用SPSS13．0软件进行统计学分析。
二、结果
食管癌细胞种植于六孔板中，培养8d时形成肉眼可见的集落，2株细胞在未受X线照射时的集落形成率在48～92%之间，符合集落形成实验要求。实验结果显示，食管癌细胞株TE－10对放射治疗较kyse－150敏感，SF2为0．388，而kyse－150的SF2为0．758(见图1－2)。两株细胞之间的放射敏感性存在显著差异。
讨论
既往研究显示，不同种不同株肿瘤细胞内在的放射敏感性是不一样的，这被称为肿瘤的固有放射敏感性。这也是影响临床放疗效果的重要因素。体外测定肿瘤细胞的固有放射敏感性，能够在一定程度上反映体内肿瘤细胞的放疗临床效应。使用分子生物学方法，对肿瘤细胞固有放射敏感性进行机制研究，能够在基因水平探究其放疗效应差异，深层次解释放疗疗效不一的根源，并帮助解决放疗抵抗的问题。因此，进行肿瘤细胞体外放射敏感性的检测，可以帮助临床制订更为有效合理的放疗计划。集落形成实验，能反映照射后离体细胞存活情况，是肿瘤细胞体外放射敏感性最经典的检测方法。照射2Gy时的存活分数SF2是代表细胞放射敏感性的重要指标。此前研究报道，不同肿瘤的放射敏感性不一致。Ｒeibeiro等［1］报道膀胱癌细胞株BL－17的SF2为0．57，而Daza等［2］报道舌鳞癌细胞株SCC－4的SF2为0．6。吴巍巍等［3］的研究显示不同胰腺细胞株的放射敏感性存在差异。细胞受照射后的死亡分为间期死亡和增殖性死亡。我们将细胞丧失了无限增殖的能力定义为放射生物学意义上的死亡，因为有的增殖性死亡出现在照射后的数个细胞周期内，也有的增殖性死亡则发生在照射后的数十个细胞周期后，因此尽量延长照射后培养的时间，可以更好地衡量存活细胞的多少。集落形成实验，培养时间一般在8～12天以上，符合这一要求。本研究显示，2株细胞在未受X线照射时的集落形成率在48～92%之间，符合集落形成实验的要求。本实验结果表明，食管癌细胞株TE－10对放射治疗较kyse－150敏感，SF2为0．388，而kyse－150的SF2为0．758(图1－A、B，表1)。两株细胞之间的放射敏感性存在显著差异。此结果表明不同食管癌细胞株间固有放射敏感性有差异。该结果可能说明食管癌的临床放疗效果不一的部分原因，提示应在临床治疗食管癌时给予个体化放疗。在未来的工作中，使用基因芯片，进一步比较两株细胞株的基因组差异，探究其放射敏感性差异背后的生物学基础，是一条重要的研究方向。除了不同种不同株肿瘤细胞株放射敏感性差异的比较，同一株肿瘤细胞株经适当处理后也可进行放射敏感性的研究。张力等［4］发现，食管癌细胞株KYSE－150经反复X线照射后，比亲本更具有放射抗拒性。这一方法可比较在同一基因组背景下照射处理后肿瘤株变化，增加了可比性，是另一个探究放射敏感性差异背后生物学基础的方法。我们将在日后工作中同时开展这一方向的工作。综上所述，本研究应用放射生物学方法，检测发现食管癌细胞株TE－10与kyse－150的放射敏感性存在显著差异，前者对放射治疗更敏感。从而为进一步研究放射敏感性差异的机制提供了基础资料，为深入研究如何提供食管癌临床疗效提供参考。
参考文献
［1］ＲibeiroJC，BarnetsonAＲ，FisherＲJ，etal．Ｒelationshipbetweenradiationresponseandp53statusinhumanbladdercancercells［J］．IntJＲadiatBiol，1997，72:11．
［2］DazaP，SchublerH，MemillanTJ，etal．Ｒadiosensitivityanddoublestrand－breakrejoiningintumorigenicandnon－tumorigenichumanepithelialcelllines［J］．IntJＲadiatBiol，1997，72:91．
［3］吴巍巍，赵玉沛，廖泉，等．人胰腺癌细胞株放射敏感性的体外研究［J］．中华肝胆外科杂志，2004，12:821-823．
［4］张力，李海英，吴式琇，等．X线反复照射人食管鳞癌细胞系KYSE－150的生物效应研究［J］．中华放射肿瘤学杂志，2010，1:60-63．
作者：华晔 赵凯 张开军 陶纲 戴东方 戴春华 邵启祥 王景芝
