1棉花雄性不育的细胞学特征
1．1核雄性不育系中的小孢子败育
小孢子的发育过程要经过复杂的生理生化变化，在这个过程中，不同发育时期伴随着不同基因的时空表达差异，而这个过程中的任何一个相关基因的突变，都会直接或间接影响小孢子的发育。因此，对于棉花核雄性不育系，小孢子败育会发生在小孢子发育的整个过程，败育时期和特征的差别仅仅因材料而不同。已报道过的棉花核雄性不育系中小孢子败育的时期和特征主要有4种类型:①造孢细胞时期:核仁增大、胞质液化、细胞形态畸形。②花粉母细胞时期:核仁穿壁，花粉母细胞中有多个核仁，在减数分裂前期Ⅰ后就退化解体，小孢子母细胞呈半月形，如ms8ms9的败育现象［10］。③单核期:胼胝质壁在减数分裂期后就溶解，小孢子外壁不出现刺突，原生质体质壁分离，随后核膜溶解，细胞质和核质解体，如陆地棉1355A(ms2)［11］和473A(ms14)［12］不育系。④双核期:小孢子产生的生殖细胞紧贴于小孢子内壁，产生的营养细胞与花粉粒原生质体一起皱缩，随后两种细胞都解体，如:ms5ms6不育系［13］。
1．2细胞质雄性不育系中的小孢子败育
姚长兵等［14］对哈克尼西棉细胞质雄性不育系的小孢子母细胞发育过程进行了细胞学研究，发现其可以形成正常的孢原细胞、造孢细胞以及小孢子母细胞，药壁分化正常，但在减数分裂前期，绒毡层提前解体，小孢子母细胞随即退化。由于绒毡层是小孢母细胞的营养源，所以推测棉花细胞质雄性不育系中小孢子母细胞败育可能与绒毡层的提前解体有关。黄晋玲等［15］发现晋A细胞质雄性不育系败育的主要时期是在造孢细胞增殖期，即小孢子母细胞形成时期，其主要细胞学特征是:造孢细胞胞内常有多个微核，不能进行正常的有丝分裂，小孢子母细胞细胞质液泡化，最终造孢细胞和小孢子母细胞提前退化，因此推测小孢子母细胞的败育与绒毡层的退化密切相关。武小平［16］对104-7A起源的细胞质雄性不育系P30A小孢子发育进行细胞形态学观察，发现P30A败育主要发生在花粉母细胞形成阶段，其主要的细胞学特征是:孢原细胞分化正常，有大量的初期花粉母细胞产生，但随后花粉母细胞细胞质液泡化，原生质紧缩，核仁消失，最后细胞解体，同时在花药发育的过程中没有明显的绒毡层细胞形成，成熟花药的药室全部充满了破裂的花粉母细胞内含物以及药室内壁物质。上述研究均证明花粉败育与绒毡层细胞发育异常有关。综合以上研究结果，细胞质雄性不育的败育时期多集中在早期，主要是造孢细胞时期和减数分裂时期，造孢细胞时期特征为有丝分裂异常;减数分裂时期特征为花粉母细胞胞质液泡化，随即解体。同时在多个细胞质不育系中观察到绒毡层较早退化，绒毡层作为小孢子发育的营养源，其较早解体必将导致小孢子发育异常。因此，胞质不育较彻底可能与绒毡层提前退化密切相关。
2棉花雄性不育的分子机理
2．1核雄性不育的分子机理研究
比较雄性不育与可育的基因表达差异，是研究核雄性不育分子机理的重要方面。Ma等［17］对比了棉花ms5ms6双隐性核雄性不育的可育株和不育株的花粉发育过程，发现造孢细胞时期、小孢子母细胞时期和花粉粒时期有17个差异表达片段，分属11种表达模式，可能参与信号转导与能量代谢等相关过程。侯磊等［18］对洞A雄性不育和可育棉花中花粉发育相关基因的表达进行分析，发现不育和可育花粉cDNA-AFLP的谱带在单核期的差异大于减数分裂期，而在花粉发育早期即花粉母细胞的减数分裂期，不育株中基因的表达减少，而且有些条带虽未消失，但表达量下降了;与可育株相比，随着花粉花药的发育，不育株在花药表型上的异常越来越明显;在花粉成熟期，产生花药中无花粉的现象。根据遗传学和细胞学试验，张天真等［19］发现陆地棉核不育系1355A的不育性状是ms2单基因控制的，因此1355A是研究核不育的重要材料。随后，王国英等［20］以1355A为材料，在F2群体中分别构建了可育系与不育系的DNA池，获得了40对(32对SSR、8个SRAP组合)多态性引物。连锁分析显示，3个SSR标记(4个多态性位点)与雄性不育基因紧密连锁。标记BNL3932800和BNL3932870距离ms2分别为1．56cM和2．08cM，位于ms2另一端的BNL236和CIR295遗传距离分别是3．23cM和4．76cM。根据棉花基因组图谱将该基因定位在14号染色体上，从而实现了陆地棉雄性核不育基因ms2的首次精细定位。目前，已克隆到多个参与棉花雄蕊发育或雄蕊特异性表达的核基因。例如，MADS-Box蛋白基因是一类转录因子，在棉花花分化早中期参与雄蕊发育，包括GhMADS1［21］、GhMADS3［22］和GhMADS-13［23］等，其中GhMADS1编码236个氨基酸，在陆地棉的花瓣、雄蕊、胚珠和纤维中表达，而在根、茎、叶等营养器官和棉花同源异型突变体CHV1(所有花器官均变为苞叶状叶性器官)的变异花蕾中不表达;GhMADS3主要在棉花的雄蕊和心皮中表达;GhMADS-13在棉花花发育早中期表达量逐步增加，后期有下降趋势，同时在雌蕊和雄蕊中表达量较高，推测GhMADS-13可能在开花诱导和花器官发育过程中起着重要作用。2009年，Wang等［24］通过荧光定量PCR和Northern杂交实验发现酰基辅酶A合成酶1基因(GhACS1)在棉花雄蕊分化的整个过程都有表达，在花药尤其是绒毡层分化中优势表达，原位杂交实验表明GhACS1在初生造孢细胞、花粉母细胞、小孢子母细胞和绒毡层细胞中表达，GhACS1的活性对于初生造孢细胞、花粉母细胞、小孢子母细胞和绒毡层细胞中脂肪酸代谢起重要作用，抑制该基因的表达会在花药发育早期影响绒毡层发育，进而导致雄性不育，因此GhACS1基因在棉花花药发育早期的小孢子发生过程中起作用，而且可能参与小孢子正常分化与发育。在成熟花粉中还发现特异表达的基因还有多聚半乳糖醛酸酶(polygalactu-ronase，PG)和第三类过氧化物酶(peroxidase，POD)基因。John等［25］研究发现PG基因在棉花花药发育后期开始表达，到成熟花粉粒时达到最大量，并且为花粉特异表达基因，表明该基因参与花药发育后期事件，与花粉成熟密切相关。研究还发现棉花中的一个花特异POD基因在花粉中优势表达，可能参与被子植物的雄蕊发育;同时一些棉花中的ClassⅢ过氧化物酶基因只在花粉中表达，表明它是棉花雄性生殖发育中的胁迫应答因子［26］。综上所述，花粉发育的过程中表达的基因参与了多个生理生化反应，如激素调节、能量变化和代谢调控等。这些基因的表达具有时空性，有些基因则具有特异性。
2．2胞质雄性不育的分子机理研究
根据现有研究结果，目前公认的胞质不育形成机制为:一方面胞质中线粒体或叶绿体基因组中的基因发生了突变或分子重排，导致该基因编码的蛋白质不能发挥功能，造成植物不育;另一方面是胞质线粒体基因发生分子重排，其产物影响了线粒体的正常功能，进而花粉发育受阻，最终导致雄性不育。王学德等［10］以哈克尼西棉细胞质雄性不育系和保持系为研究对象，发现不育系中缺少一条分子质量约为31kDa的多肽片段，线粒体DNA缺少1条1．9kb的片段，该片段与COX1基因具有同源序列，推测胞质雄性不育可能是由于线粒体基因组发生突变或重排，造成COX1基因的变异引起的。黄晋玲［27］以陆地棉晋A细胞质雄性不育系和保持系为研究对象，也发现在线粒体基因atp6和COX1基因的杂交带中，不育系分别缺少5．7kb和4．2kb的强杂交带。同时，Christine［28］发现目前至少有14个线粒体基因与细胞质不育有关，它们的共同特征是基因的开放阅读框由已知线粒体基因的编码序列、已知基因的侧翼序列和未知区域的序列共同组成。蒋培东［29］研究了哈克尼西棉细胞质雄性不育的机理，推测线粒体中coxⅢ基因的突变和线粒体结构异常，导致线粒体呼吸链异常，活性氧清除酶活性和抗氧化酶降低，从而使花药中积累大量的应激活性氧，对细胞发育产生了毒害。黄晋玲［27］在酶切基因组DNA后发现二者有8个多态性的叶绿体CAPS标记。2009年，马勇等［30］以哈克尼西棉细胞质雄性不育系的败育高峰期———花粉母细胞减数分裂之前的花药和同型保持系相同时期的花药为材料，利用cDNA-AFLP技术进行差异片段分析，其中差异片段有在不育系中上调(或特异)表达的基因，也有在保持系中上调(或特异)表达的基因，这些差异基因主要参与信号转导、转录、能量代谢、RNA编辑、细胞程序化死亡和雄配子发育等相关过程。因此，通过研究不育系和保持系在叶绿体和线粒体基因组结构、转录和翻译产物方面的差异，证实棉花胞质雄性不育系的形成原因可能存在于线粒体和叶绿体的遗传系统中，尤其是线粒体。由此，张晓等［31］开发出可鉴定棉花可育胞质与不育胞质的3个分子标记，分别是SSR160、SCAR515和SCAR555。其中SSR160是线粒体基因atpARFLP片段3'端的一个SSR位点，在可育胞质中为(TAA)7(TA)6，在哈克尼西棉CMS系(CMS-D2)、陆地棉和海岛棉的不育胞质中是(TAA)3(TA)2，而在三裂棉CMS系(CMS-D8)胞质中是(TAA)4(TA)3;SCAR515和SCAR555是atpA截短型拷贝RFLP片段上可育胞质与不育胞质中分别存在一段515bp和555bp的差异序列，而且这两条差异序列完全不同。由于三裂棉CMS系(CMS-D8)胞质与其他CMS系的差异，张晓等［31］根据SNP位点，开发出CMS-D8特异分子标记SCARD8。研究细胞质雄性不育系机理的目的，除了寻找不育基因外，还为了研究恢复基因对育性的调控。一般认为，雄性不育系的细胞质中存在不育基因S，而核内则有相对应的一对或一对以上的隐性基因rfrf。而恢复系核中的恢复基因(restoreroffertility，Rf)能抑制CMS的表型，具有使不育恢复为可育的功能。以基因型表示为:不育系为S(rfrf)，保持系为N(rfrf)，恢复系为S(RfRf)或N(RfRf)。关于棉花细胞质雄性不育的育性恢复机理已取得了一些初步的研究进展。目前，主要通过图位法或者差异分析法进行研究。图位法即通过构建遗传图谱和物理图谱克隆恢复基因。2006年，Yin等［32］报道通过构建与恢复基因连锁的遗传图谱和物理图谱，将恢复基因定位在第19号染色体上，物理定位于2个基因组BAC克隆100kb的重叠区域中。2008年，侯思宇［33］在(不育系P30A×恢复系Y18R)×保持系P30B回交群体中发现，子代育性分离比1∶1(不育∶可育)，符合孟德尔遗传规律，这表明育性恢复性状是由一对显性基因控制的;随后以恢复系Y18R为材料构建了与恢复基因连锁的遗传图谱，在图距总长为13．2cM中，STS147标记与恢复基因的遗传距离为0．1cM，同时发现了一个与恢复基因遗传距离为2．4cM的新标记MGH-ES28。以棉花三系为研究材料，也可以通过花发育基因的表达差异分析育性恢复机理。Zhang等［34］以棉花D8胞质雄性不育系的杂合体(携带有恢复基因)和正常可育(不含有恢复基因)保持系的花药组织为研究对象，使用差异显示技术，发现了一些上调或者下调的基因，推断它们与花药发育相关，并指出恢复基因不是一个花粉特异表达的基因。综上所述，细胞质雄性不育与恢复的机理可归纳为:①不育系线粒体的CMS基因改变了线粒体的一些代谢与能量状态，包括呼吸链的改变;②恢复基因对CMS基因的功能具有抑制作用;③不育胞质线粒体的状态对其细胞核发出信号，使该不育胞质的细胞核内与雄蕊发育的相关基因表达异常，激活、抑制或进入程序性死亡，在线粒体与细胞核内参与信号传递作用的系统可能有活性氧、磷酸化、钙等信号系统;而细胞核内决定花器官形成的MADS-box转录因子或参与程序性死亡的蛋白质则被认为是CMS基因作用的靶蛋白［35］。
3棉花雄性不育的应用
3．1核雄性不育系的培育方法与应用
棉花的核雄性系主要来源于自然突变体、人工转育以及基因工程创造。如国内的洞A，其原始不育系就是一株天然雄性不育株。靖深蓉等［36］利用人工转育，将双隐性核雄性不育系ms5ms6不育基因转育到高产、耐黄萎病品种中棉所12，育成了同质异核不育系和异质同核不育系，改良了的双隐性核不育系并保持了原ms5ms6的不育性稳定而且彻底的特点，同时还去除了原双隐性不育系的缺陷，如不抗风暴等。目前，利用植物基因工程和细胞工程的手段培育雄性不育系已逐渐成为主要的研究方法。Aarts等［37］从拟南芥中克隆了雄性不育基因，再通过遗传工程法改造花药绒毡层的遗传组成，创造了棉花等农作物的核雄性不育系。张慧军等［38］利用TA29、A6、A9三个启动子的功能区与Barnase基因融合构建表达载体，用农杆菌介导法对棉花下胚轴进行了遗传转化，获得了带有Bar-nase不育基因的120株转基因再生植株。同时利用基因工程技术在载体中加入了bxn基因，以赋予转基因植株抗溴苯腈的能力，从而通过喷施溴苯腈杀死育性恢复植株，使不育材料得到保持。2010年，张玉芹等［39］利用农杆菌介导T-DNA插入得到棉花雄性不育突变体，这为利用T-DNA标签法进行雄性不育有关基因的克隆奠定了基础。不育系“一系两用法”利用棉花杂种优势较早、推广面积较大的国家之一。目前，国内已培育出洞A、川A、无62-1A等多个棉花核雄性不育系。其中，4个陆地棉核雄性不育系洞A、81A、1355A和阆A都是单基因隐性遗传，而在核雄性不育系育成的杂交品种中，利用ms5ms6选育的品种有南农98-4、中棉所38和印度的Suganan等，其他品种主要是利用ms14选育的。由于其他核不育本身存在显性遗传和部分不育等缺陷，不利于生产中应用，因此目前常用的核雄性不育基因型主要为上述几种。国内选育并且利用较早也较多的单隐性核雄性不育两用系主要有洞A和芽黄81A。目前，利用洞A种质已转育成功751A、473A、83-IA、抗A1、抗A2、GA5和33A等衍生不育系，以及抗虫两用系抗A3和GA18等。利用洞A种质转育的两用系先后选育出川杂一号、川杂四号、川杂六号、鲁棉八号等高优势组合。除此之外，现在已培育了核雄性不育杂种棉组合几十个，到20世纪90年代末，核不育系在杂交棉上得到了大面积应用。与此同时，国内外对双隐性核不育也进行了研究与应用。其中，我国利用新双隐性核不育系与自主构建和转育的Bt抗虫基因品系杂交选育出了抗虫杂交棉中抗杂A(中棉所38号)，是国内首个通过国家审定的拥有自主知识产权的抗虫杂交棉。南京农业大学利用msc5msc6双隐性核不育基因培育出了南农6号［40］、南农9号［41］和98-4［42］等抗虫核不育杂交品种。4．1．3标记核不育系的研究标记核不育系是通过指示性状在苗期就可分辨出不育株和可育株，可提高制种效率，更有利于生产中的应用。81A(ms16)就是带芽黄标记性状的单隐性核不育系［43］。
3．2胞质雄性不育系的培育与应用
20世纪60年代，Meyer等［3］育成了具有哈克尼西棉胞质(G．harknessiiBrandegee)的DES-HAMS277和DES-HAMS16不育系(D2－2)及其保持系和恢复系，实现了三系配套。90年代，Stew-art等［5］育成了具有三裂棉细胞质的不育系(D8ms)及相应保持系和恢复系(D8mf)。国内湖南省棉花所于1979年通过海岛棉×陆地棉×瑟伯氏棉(G．thurberiTod)杂交，选育出海岛棉胞质雄性不育系湘远A。贾占昌等［7，8］以陆地棉(石短5号)为母本，海岛棉(军海棉)为父本，经多代杂交，选育出具有陆地棉(AD1)胞质的新型不育系104-7A。1996年，山西农业大学和山西农科院通过种间复式杂交的方法，从(陆地棉×瑟伯氏棉)×(亚洲棉×陆地棉)的杂交后代中选育出新的细胞质雄性不育系，名为晋A胞质雄性不育系，它具有二倍体亚洲棉和野生棉的遗传背景［6］。2000年，李蒙恩等［44］以哈克尼西棉胞质不育系DES-HAMS277育成了中A和PA等4个优良的不育系。根据现有报道，目前已有哈克尼西棉、三裂棉、异常棉、亚洲棉和陆地棉胞质雄性不育系，其中只有哈克尼西棉、三裂棉和陆地棉的不育系实现了三系配套。目前国内也已培育出多个优良的恢复系。王学德［45］将一个具有抗逆性能的谷胱甘肽S转移酶(glutathioneS-transferase，GST)基因导入恢复系DES-HAF277中，培育出“浙大强恢”。与DES-HAF277相比，“浙大强恢”对不育系的恢复力提高了25．8%，从而使杂种F1单株结铃数平均多3．6个，不孕籽率降低了10．l%，皮棉产量提高了10.6%。华金平等［46］采用远缘杂交的手段，利用来源于异常棉的恢复基因，育成了陆地棉×异常棉杂种后代恢复系，该恢复源自身育性好，花粉充足，而且可完全恢复哈克尼西棉胞质不育系的育性。2005年，采用基因工程技术培育的“银棉2号”［47］，是我国第一个国家审定的三系杂交抗虫棉新品种，它在生产上不但解决了棉铃虫的危害，而且比常规抗虫棉增产26．4%。该品种突破了以往三系杂交棉无产量优势或产量优势不明显的瓶颈，在技术上处于国际领先水平，同时使棉花产量大幅度提高。“银棉2号”的母本为不育率和不育度均达100%的棉花细胞质雄性不育系P30A，其遗传起源为我国研制的陆地棉胞质不育系104-7A，;恢复系Y18R遗传起源于引入恢复系0-613-2R，并聚合了我国陆地棉的品种中的恢复加强基因，其杂种一代的恢复度达到100%。2008年，转抗虫基因中熟三系杂交品种“银棉8号”又取得农业转基因生物生产应用安全证书(转基因生物名称为SGKz34-3)，符合国家棉花品种审定标准，通过审定。
4存在的问题及解决方法
4．1有关棉花雄性不育的分子机理研究滞后
有关棉花雄性不育的分子机理，尤其是胞质不育的机理，尚缺乏足够的分子生物学证据。目前对哈克尼西棉胞质、三裂棉胞质和陆地棉胞质的雄性不育的机理有一定的了解，但还不够深入，而对于海岛棉胞质的雄性不育得机理则知之甚少。一方面，雄性不育的机理，尤其是胞质不育，可能情况较为复杂;另一方面，棉花基因组很大，从分子水平上研究也存在很多困难，这两方面导致胞质不育的分子生物学研究滞后。随着新的研究技术和方法的不断出现，这为加快研究提供了条件。比如，针对棉花基因组较大的特点，可以构建BAC文库或TAC文库，再利用分子标签筛选目的基因。
4．2现有雄性不育系在生产应用上存在的缺陷
生产中应用的不育系主要有核不育系和胞质不育系两种类型，但都存在一定缺陷。核雄性不育系主要是育性不够稳定，而且保持不育难，生产上能够应用的品种较少;同时，虽然可以一系两用，但必须拔除一半的可育株，这会影响杂交种制种产量。对于细胞质雄性不育系，由于其胞质含有产量不利因子，因而育性较难恢复，恢复源狭窄，而且杂种优势不够强。对于目前雄性不育存在的缺点，可通过以下方法解决:鉴于现有核不育的育性不稳定的现象，可运用转基因工程技术，将构建的嵌合基因转化植株，培育新的雄性不育材料。例如，用花粉特异启动子驱动细胞毒素基因表达，细胞毒素能选择性地破坏与花药发育相关的器官或组织，从而获得不育材料;还可以通过RNA干扰技术阻断与花粉发育相关基因的表达以获得雄性不育材料。对于胞质不育，细胞质对杂种F1代的产量和早熟性等性状造成的影响，以及恢复源狭窄和恢复力弱的缺点，可以运用基因工程手段和传统育种互补的方法，转入有益基因或远缘杂交来丰富亲本的种质基础，增强高产、抗病、抗虫耐盐碱等特性，同时选育优良的不育系和恢复系，来提高恢复系的恢复力，如恢复系Y18，对26A来源的所有不育系可100%恢复。
5展望
棉花雄性不育在生产上有很多优势，如用工少，制种成本低，制种效率高等，而且杂种一代可以复合抗病、高产等多个优良品质于一体，因而棉花雄性不育系在生产上有着很高的应用价值。同时，由于雄性不育的分子机理对培育棉花新品种和改良棉花品质都具有重要的意义，因此对于雄性不育分子机理的研究已成为一个热点。在对雄性不育系的研究方面，突破点是弄清雄性不育的分子生物学基础，研究其不育机理和选育利用工作。目前，克隆不育基因或恢复基因多从基因组水平加以研究，今后还可以尝试从转录水平或翻译水平入手。同时在不育系育种方面，通过利用现有不育系的基础上，努力创造更加优良的不育系类型。缺乏强优势组合是制约棉花杂种优势利用的重要因素。解决这一问题的主要途径有:①筛选强优势组合亲本。今后要加强向优良亲本材料转育抗病、抗虫、高强纤维、耐旱碱等性状，以培育出优质、高产和高抗的特色品种;②利用雄性不育系杂交制种;③在技术上可选择常规品种选育与杂种优势利用相结合的方法，同时，利用现代先进的育种手段加速对优良品种培育的进程。
作者：石雅丽 张锐 任茂智 孟志刚 周焘 孙国清 孟钊红 郭三堆 单位：中国农业科学院生物技术研究所
