摘要：目的研究急性髓细胞白血病（AML）患者乳腺癌耐药蛋白（）基因的表达以及在预后判断中的意义。方法构建实时定量PCR检测基因表达的技术，定量检测20例初治组AML患者、20例完全缓解组AML患者及20例难治复发组AML患者基因的表达水平，分析其在AML患者和非血液系统恶性肿瘤患者中的差异及与临床疗效的关系。结果急性髓系白血病患者中的表达高于对照组（<0.01），初治组、完全缓解组、难治复发组的表达均存在差异（<0.01），其中难治复发组表达最高，初治组次之，完全缓解组最低。结论基因在急性髓系白血病患者中表达增高，的表达水平可能是疾病进展的重要标志，可能是AML的独立危险因素。
关键词：急性髓系白血病；基因；危险因素
中图分类号：R733.7 文献标识码：A
急性髓系白血病（acutemyeloidleukemia，AML）是一组临床和生物学行为存在高度异质性的疾病，AML的发生是由于髓系白血病细胞增殖失控、分化障碍、凋亡受阻，但其具体病因和发病机制尚未完全清楚。化学治疗是其主要的治疗方式，多重耐药（multidrugresistance，MDR）是导致化疗耐药一个重要途径，进而导致其治疗失败。国内外研究发现，与MDR相关的基因包括/、/、/和/基因等[1-2]。乳腺癌耐药蛋白（breastcancerresistanceprotein，BCRP）基因位于染色体4q22，全长66kb。BCRP属于ABC转运蛋白超家族（ATPbindingcassettetransporters）G亚族的第2位成员，在肿瘤细胞的侧群细胞中高表达，是一种与肿瘤耐药相关的半转运蛋白[3]。多项研究表明，基因的高表达可以导致化疗耐药，包括米托蒽醌、柔毛霉素、阿霉素、托泊替康等[4]，从而影响AML患者的完全缓解期以及生存期，导致不良预后[5-6]。Damiani等[7]的研究表明，在成人AML患者中氟达拉滨化疗治疗不能抑制基因高表达的负效应。Damiani等[8]的最新研究表明，高表达基因可影响异体骨髓干细胞移植的效果，会导致更短的白血病无病生存期以及更高的累积复发率[9]。Tiribelli等的研究表明，同时出现基因过表达和FLT3-ITD突变可以导致AML患者出现高复发风险。有研究[10]认为，导致AML患者化疗耐药的作用是有限的。为进一步探讨基因在AML中的表达及其预后意义，本研究检测60例AML患者和20例非恶性血液病患者基因的表达量并探讨其临床预后意义。
1材料与方法
1.1病例资料AML标本：病例为2011年9月-2014年9月期间湖南省人民医院血液科经细胞形态学、组织化学染色及流式细胞术免疫学分型确诊的AML患者。具体如下：AML患者60例，男33例，女27例。M1（急性粒细胞白血病未分化型）：3例，M2（急性粒细胞白血病部分分化型）：19例，M3（急性早幼粒细胞白血病）：15例，M4（急性粒单细胞白血病）：11例，M5（急性单核细胞白血病）：11例，M6（红白血病）：1例。其中初治病例20例，男9例，女11例，年龄19～81岁，中位年龄44.5岁；完全缓解病例20例，男13例，女7例，年龄11～66岁，中位年龄43岁；难治复发病例20例，男11例，女9例，年龄16～75岁，中位年龄42.5岁。对照组：20例非血液系统恶性肿瘤及非恶性实体瘤患者（包括ITP或缺铁贫、白细胞减少等），男9例，女11例，年龄15～82岁，中位年龄44岁。1.2主要仪器与试剂Realtime-PCR仪（ABI）7900型，水平电泳槽（北京君意东方仪器公司），JY-SPC，电泳仪（北京鼎国生物技术发展中心），DG-Ⅲ双稳数显电泳仪，高速离心机（SIGMA）1-13。TrizolRNA抽提试剂盒（In-vitrogen，15596-026），RevertAidTMHMinusFirstStrandcDNASynthesisKit逆转录试剂盒（Fermen-tasK1631），DeoxyribonucleaseⅠ脱氧核糖核酸酶Ⅰ（FermentasEN0521），RiboLockTMRibonucleaseIn-hibitor核糖核酸酶抑制剂（FermentasEO0381），SYBRGreenPCRMasterMix（ABI4309155）。1.3引物的合成正向引物序列为：5'-ACCTGAAGGCATTTACTGAA-3'，反向引物序列为：5'-TCTTTCCTTGCAGCTAAGAC-3'，产物长度214bp，TM值59℃。采用β-actin为内参基因，正向序列为：5'-CATTAAGGAGAAGCTGTGCT-3'，反向序列为：5'-GTTGAAGGTAGTTTCGTGGA-3'，片段长度为208bp。1.4RT-PCR检测mRNA表达收集AML实验组和对照组骨髓单个核细胞，用TrizolRNA抽提试剂盒提取实验组与对照组的总RNA，紫外分光光度仪检测RNA的浓度和纯度。取2μgRNA样品，按照试剂盒说明书逆转录成cDNA。25μlRT-PCR反应体系：1μlcDNA模板，100nmol引物A和引物B，12.5μl2×SYBRGreenPCRMastermix，灭菌双蒸水加至25μl。反应条件为反转录后95℃、5min，94℃变性20s，61℃退火20s，72℃延伸20s，40个循环后72℃、5min，55℃退火10s，往后每个循环加0.5℃，80个循环。循环结束后进行融点曲线分析，于60℃～95℃之间进行测定，条件设置为升温幅度0.5℃/次，5s/次。反应结束后软件自动算出mRNA拷贝数。考虑到各个样本总RNA浓度可能存在差异，最终计算结果采用2-ΔΔCt（RQ）值（Ct基本循环数、ΔCt=基本循环与内参循环数差值、ΔΔCt*=最低样本ΔCt值-其他各样本ΔCt值）来表达基因的表达水平。反应结束后取PCR产物在琼脂糖凝胶电泳中分离，紫外灯下观察并拍照。1.5统计学方法采用SPSS13.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两样本均数比较用检验和Mann-Whitney检验，<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1基因的表达水平在AML患者与对照组的比较RT-PCR显示60例AML患者及20例对照组患者均可检测到基因的mRNA表达，使用β-actin内参基因校正。使用SPSS13.0软件获得的mRNA半定量均值。统计分析显示，AML患者中初治组、缓解组、复发组的mRNA相对表达量均高于对照组，差异有统计学意义（<0.01）（见附表）。2.2AML患者不同病程阶段基因表达水平的变化根据初治组20例、缓解组20例和复发组20例患者的基因的mRNA相对表达水平，Mann-Whitney检验显示，初治组与完全缓解组比较差异有统计学意义（<0.01），初治组与复发组比较差异有统计学意义（<0.01），缓解组与复发组比较差异有统计学意义（<0.01）。即3个病程下基因的表达水平在复发组中表达最高，初治组次之，缓解组表达最低。
3讨论
目前，治疗AML的方法主要有化学治疗、造血干细胞移植及生物靶向治疗等。在治疗过程中，化疗耐药是导致治疗失败的一个重要原因。多重耐药通过上调膜转运蛋白将肿瘤细胞中的化疗药物泵到体外，从而导致化疗耐药[3]。ABC转运蛋白超家族是导致MDR的一类重要物质，BCRP是ABC转运蛋白超家族G亚族的第2位成员，近年来受到越来越多的研究者的关注。本研究中，基因在不同病程的AML患者中的表达显著高于对照组，同时，在AML的不同病程中，复发组的基因表达最高，初治组次之，缓解组最低，提示基因高表达与AML疾病的发生有关，同时，基因高表达可导致疾病更易复发，可能与其导致的化疗耐药有关。基因可能成为改善AML预后，延长患者完全缓解期、降低复发率的重要生物学靶点。基因的表达对AML的治疗有重要意义，目前更多的研究已经深入到化疗耐药机制的研究，Huang等人[11]的研究表明，在成人急性白血病中，通过PI3K/Akt途径使PTEN蛋白失活可上调表达和侧群细胞。Campbell等人[12]的研究则在儿童M7AML中发现一个新的、BCRP组织特异性启动子。因此，研究基因高表达导致AML化疗耐药的信号通路机制将是一个值得深入研究的方向。
作者：李薇 周明 罗科玲 谭熹 雷平 邹彬宾 单位：湖南省人民医院
