1细胞生长曲线
采用MTT法绘制细胞生长曲线。取第7代近融合的肠上皮细胞,消化后调整细胞密度为1×105/mL的单细胞悬液,接种于96孔板中,每孔接种100μL,接种15板,每3d更换一次细胞培养液。每天于相同时间取出一板细胞,每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20μL,培养4h后,吸出孔内上清,每孔加入二甲基亚砜150μL,震荡10min后于酶联免疫检测仪以490nm波长测吸收值。共测定15d,以时间作为横坐标,光吸收值(D)作为纵坐标,绘制细胞生长曲线。1.8流式细胞术(flowcytometry,FCM)分析细胞周期常规方法收集第7代近融合的肠上皮细胞,PBS洗涤2次,在离心管中留约0.5mL的PBS,向细胞悬液中缓慢加入75%冰乙醇,–20°C固定过夜。检测前,1000r/min离心3min去除乙醇,PBS清洗1次,加入适量碘化丙啶染液(0.1%TritionX-100,10μg/mL碘化丙啶,50μg/mLRNase),室温避光染色30min,上机检测,计数10000个细胞,用MuticycleAV软件进行DNA细胞周期拟合分析。增殖指数(proliferativeindex,PI)指增殖细胞占总周期细胞的比例,S期细胞指数(S-phasefraction,SPF)指细胞周期中处于S期细胞所占的比例。采用PI和SPF分析细胞的增殖活性,PI(%)=(S+G2/M)/(S+G2/M+G0/G1)×100%,SPF(%)=S/(G0/G1+S+G2/M)×100%。1.9染色体核型分析参考已报道的方法[13],稍作修改。传代细胞以1×105/mL的密度接种至96孔板。48h后换液,给予浓度为2μg/mL秋水仙素处理3h;消化收集细胞,37°C低渗(0.075mol/LKCl)处理20min;用新鲜配制(4°C预冷)的卡诺固定液(甲醇:冰醋酸=3:1)预固定20min,离心去除上清,再视细胞量加入新鲜固定液0.5~1mL,以移液枪重悬沉淀;取出–20°C预冷的玻片,30cm高度滴片;空气干燥,吉姆萨工作液染色10min,脱色,在显微镜下选择分散良好,形态清晰的染色体中期分裂相,进行拍照,用Photoshop软件进行染色体核型分析。
2结果
2.1IEC-P.A.的细胞形态与超微结构
用嗜热菌蛋白酶和I型胶原酶联合消化参环毛蚓肠组织,获得的大量隐窝单位和散在细胞。隐窝单位培养48h即能贴壁,72h开始辐射出零星细胞;而散在的肠上皮细胞贴壁所需时间较长,接种一周才可形成少量的细胞集落(图1A),15d开始贴壁,但附着不稳定,稍振动即浮起。约28~30d细胞生长至85%~90%汇合,可进行传代培养。原代培养时有较多的细胞碎片,且上皮细胞与成纤维细胞夹杂生长,传至第3代以后,细胞碎片明显减少,类圆形上皮细胞数量增多,形态较一致。传代后细胞生长稳定,培养13~15d可见肠上皮细胞汇合成细胞单层,呈典型“铺路石样”镶嵌排列,边界清晰,互不重叠(图1B)。透射电镜下观察培养的肠上皮细胞,可见细胞结构完整,直径为8±2μm,具有典型的肠上皮隐窝细胞特征。微绒毛从细胞表面伸出,排列整齐(图2A),近绒毛端胞质中分布丰富的线粒体,其嵴清晰可见(图2B),细胞核周区域有大量的粗面内质网(图2C)。
2.2IEC-P.A.的生长曲线
第7代参环毛蚓肠上皮细胞的生长曲线见图3,体外培养的肠上皮细胞存在着明显的潜伏期,接种培养7~9d后才能进入对数生长期,经过大约4d的对数生长期后,至13~15d开始进入平台期,且能相对较长时间维持在这一时期。
2.3FCM分析IEC-P.A.细胞周期
参环毛蚓肠上皮细胞的细胞周期检测结果见图4,细胞各个时期的分布状态是G0/G1期为(93.13±0.12)%,S期为(3.73±0.23)%,G2/M期为(3.14±0.17)%,细胞的增殖活性指标PI为6.87%,SPF为3.73%。由此可见,体外培养的肠上皮细胞接种后,相对较长时间处于静止期,尚未进行增殖分裂活动。
2.4IEC-P.A.染色体核型分析
本实验所培养的肠上皮细胞来源于环节动物门的参环毛蚓,具有一定的特殊性,与常规哺乳动物的细胞差异较大。处于中期分裂相的肠上皮细胞所占比例较少,且处于分散状态的染色体臂常常出现部分重叠(图5A),但尚可应用Photoshop软件进行核型分析。根据所拍摄的20个细胞的中期分裂相,可以得出,参环毛蚓肠上皮细胞的染色体数为2n=22,其中第1、2、5、8、9、11号染色体为中部着丝粒染色体,第4、7、10号染色体为亚中部着丝粒染色体,第3、6号染色体为亚端部着丝粒染色体,其染色体核型可表示为n(♂)=x=6m+3sm+2st(图5、表1)。整体来说,第3代参环毛蚓肠上皮细胞染色体没有异常表现,基因组相对稳定。
3讨论
体外培养的肠上皮细胞对于研究营养物质的吸收代谢机制、药物作用以及各种致病因素作用下的生理病理改变具有重要意义,所取得的研究成果可以为人工养殖活动提供科学指导,从而带来巨大的经济效益[14]。目前,蚯蚓种属肠上皮细胞培养与生物学特性研究尚未见报道。本研究采用混合酶消化法对参环毛蚓肠上皮细胞进行分离培养,稳定传至第8代,并研究了细胞形态、超微结构、生长曲线、细胞周期和染色体核型等生物学特性,成功获得参环毛蚓肠上皮细胞系(IEC-P.A.)。不仅丰富了环节动物门的细胞资源及相关生物学特性资料,而且所建立的细胞培养技术及生物学特性检测方法可以为蚯蚓种属细胞培养及研究提供参考。分离肠上皮细胞常用的消化酶包括胰蛋白酶、胶原酶、嗜热菌蛋白酶及中性蛋白酶。由于来源动物不同,关于各种消化酶的分离效果有不同的报道,其中嗜热菌蛋白酶分离肠上皮细胞可获得大量的健全绒毛隐窝单位,且传代后增殖能力比较稳定[15-17]。本实验参考上述条件,对消化酶进行了适当调整,筛选确定嗜热菌蛋白酶和I型胶原酶的混合酶液较适合分离参环毛蚓的肠上皮细胞。所得细胞悬液可见大量肠上皮细胞特有的隐窝单位。细胞鉴定是肠上皮细胞培养过程中一个重要内容。除了观察形态特征外,常用的有碱性磷酸酶染色法、电镜法及免疫荧光染色法[18]。由于碱性磷酸酶染色法影响因素复杂,阳性率低;又因亲缘性的关系,参环毛蚓肠上皮细胞缺少特异性标记物,而无法使用免疫学鉴定,所以本研究选取了透射电镜观察参环毛蚓肠上皮细胞的超微结构。细胞表面可见大量微绒毛,胞内含有丰富的线粒体、粗面内质网,符合肠上皮细胞的特征。应用流式细胞技术,对核酸染料标记的DNA进行检测,能够得到细胞各个时期的分布状态,通过计算G0/G1、S、G2/M期的百分数,可以进行细胞周期分析,了解细胞的增殖能力[19]。常规测定时多选用碘化丙啶染料对DNA染色,但本实验中发现碘化丙啶不能对75%冰乙醇固定的参环毛蚓肠上皮细胞的DNA进行染色。分析其原因可能是碘化丙啶无法进入参环毛蚓的细胞内所致。为此,本团队通过添加不同浓度TritionX-100进行破膜,最终选取的染色液组分为0.1%TritionX-100、10μg/mL碘化丙啶、50μg/mLRNase,使FCM分析参环毛蚓IEC细胞周期的检测得以顺利进行。但结果中变异系数(coefficientofvariation,CV)值、细胞碎片含量(%Debris)较高,表明此破膜染色方法还有待于进一步优化。S期细胞比率(SPF)和增殖指数(PI)均可以反映细胞群体的增殖状态和DNA的合成速度,因此常用它们的大小来表示细胞增值活性的高低[20]。
本研究中参环毛蚓的PI为6.87%,SPF为3.73%,客观证实了体外培养的参环毛蚓IEC具有漫长的DNA准备期,接种初期增殖分裂能力相对较低,与该细胞生长曲线中潜伏期(7~9d)较长相符。国内外关于寡毛纲动物的染色体研究报道较少,国内仅许智芳[21-22]报道了赤子爱胜蚓(Eiseniafoetida)、正方拟爱胜蚓(E.tetraedratypical)、夹杂带丝蚓(L.variegatus)的染色体核型分析;国外的相关研究也只限于寡毛纲的少数物种[23-24],但这些都未涉及参环毛蚓。本研究首次对体外培养的参环毛蚓肠上皮细胞进行染色体数目分析,发现其染色体为二倍体,2n=22,与许智芳[21]报道的赤子爱胜蚓、大平二号(Ohira2)、北星二号(Kitoshi2)的染色体数目一致。此外,本文按着丝点的位置对染色体进行了命名和分类,其中第1、2、5、8、9、11号染色体为中部着丝粒染色体,第4、7、10号染色体为亚中部着丝粒染色体,第3、6号染色体为亚端部着丝粒染色体,而赤子爱胜蚓、大平二号、北星二号均为端部着丝粒染色体,造成这种差异可能是因为参环毛蚓与赤子爱胜蚓的种属不同,但也不排除研究者所用方法以及测量误差的影响。雌雄同体的寡毛纲中,多倍体是常见的[25-27],而本研究中未发现多倍体,因此关于参环毛蚓是否存在多倍体,尚有待于展开更深入系统的研究。本研究首次建立了参环毛蚓肠上皮细胞系IEC-P.A.,获得了相关的生物学特性资料,不仅填补了国内外关于环节动物门蚯蚓种属肠上皮细胞离体培养的研究空白,而且为今后在细胞和分子水平进行参环毛蚓生理功能、遗传育种、疾病防治等方面的研究奠定了坚实的基础。
作者：陈立红 李薇 卢瑞珊 侯雪芹 林小桦 龚玲 单位：广州中医药大学中药学院
