1改良的CTAB法
(1)加入1000μL65℃预热的处理液,使之充分混匀,4℃12000r/min离心机离心10min使之分层,倒掉上清液。(2)加入800μL65℃预热的CTAB,3μLβ-巯基乙醇,在65℃水浴锅中预热40-60min,期间轻轻摇匀几次。(3)加入等体积的酚:氯仿:异戊醇,缓慢反转离心管10min,使内含物充分混匀后并成乳浊液,在4℃12000r/min离心机上离心10min使之分层,取上清液,转入1.5mL离心管中。(4)加入等体积氯仿:异戊醇,缓慢反转离心管10min,使内含物充分混匀后并成乳浊液,在4℃12000r/min离心机上离心10min使之分层,取上清液,转入1.5mL离心管中。(5)重复第4步。(6)在抽提的上清液中加入其2/3体积的-20℃预冷的异丙醇,轻轻摇匀离心管,放入-20℃冰箱内沉淀40min。(7)4℃12000r/min离心机上离心8min,弃上清液,用600μL75%乙醇清洗沉淀,4℃12000r/min离心8min,重复此步骤一次。(8)用600μL无水乙醇清洗沉淀,4℃12000r/min离心8min,倒掉液体。(9)然后将沉淀至于温室下自然风干。(10)自然风干后,加入100μLTE缓冲液。改良的SDS法(1)加入1000μL65℃预热的处理液,使之充分混匀,4℃12000r/min离心机离心10min使之分层,倒掉上清液。(2)加入1000μL65℃预热的SDS提取液,加入100μL5mol/LKAc(pH4.8),加入10μLβ-巯基乙醇,少量PVP粉,充分混匀后于65℃水浴30min。4℃12000r/min离心10min,吸上清液。(3)加入等体积的酚:氯仿:异戊醇,缓慢反转离心管10min,使内含物充分混匀后并成乳浊液,在4℃12000r/min离心机上离心10min使之分层,取上清液,转入1.5mL离心管中。(4)加入等体积氯仿:异戊醇,缓慢反转离心管10min,使内含物充分混匀后并成乳浊液,在4℃12000r/min离心机上离心10min使之分层,取上清液,转入1.5mL离心管中。(5)重复第4步。(6)在抽提的上清液中加入其2/3体积的-20℃预冷的异丙醇,轻轻摇匀离心管,放入-20℃冰箱内沉淀40min。(7)4℃12000r/min离心机上离心8min,弃上清液,用600μL75%乙醇清洗沉淀,4℃12000r/min离心8min,重复此步骤一次。(8)用600μL无水乙醇清洗沉淀,4℃12000r/min离心8min,倒掉液体。(9)然后将沉淀至于温室下自然风干。(10)自然风干后,加入100μLTE缓冲液。
2DNA的含量检测
2.1电泳检测取DNA样品4μL与2μL6×Loadingbuffer混匀后上样,1×TAE电泳缓冲液,8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量,2000bpMarker6μL,120V电泳20min,电泳结束后,在凝胶成像系统下观察照相。2.2DNA纯度与质量浓度检测用NanoDrop2000微量紫外-分光光度计测定样品液的纯度及质量浓度。
3结果与分析
3.1紫外分光光度计测定
分别将8种不同方法提取的木棉DNA样品在紫外分光光度计下测量其产率及A260/A280的比值,可以得出木棉基因组DNA质量浓度:改良的CTAB法>改良的磁珠法试剂盒>磁珠法试剂盒>普通试剂盒法>改良的普通试剂盒法>改良的SDS法>CTAB法>SDS法；除改良的普通试剂盒DNA产率下降外,其余三种方法CTAB法,SDS法及磁珠法试剂盒经过改良后DNA产率都有所提高且CTAB法十分显著。就其A260/A280的比值可以得出DNA的纯度:改良的磁珠法试剂盒>改良的普通试剂盒法>磁珠法试剂盒>改良的CTAB法>普通试剂盒法>改良的SDS法>CTAB法>SDS法。此外,经过改良后DNA纯度都有所提高,且CTAB法和SDS法比较明显,经改良后的磁珠法试剂盒A260/A280的平均比值为1.93在1.8-2.0之间纯度较高,其余方法均在1.8以下,存留蛋白质多糖等次生代谢物质。综合DNA得率及纯度比较分析可以得出:改良的磁珠法试剂盒提取的木棉基因组DNA效果最佳。
3.2八种方法提取木棉基因组DNA的电泳检测结果
从8种方法提取DNA的琼脂糖电泳图谱(图1)可以看出,常规CTAB法和常规SDS法均有严重的拖带现象,且点样孔有残留物,DNA条带不清晰甚至没有。普通试剂盒与磁珠法试剂盒DNA主带比较清晰,无拖带现象,但点样空有轻微的残留物。从电泳图谱(图2)可以看出除改良的SDS法DNA主带不清晰,其余三种改良的CTAB法、改良的普通试剂盒法及改良的磁珠试剂盒法DNA主带清晰,无拖带现象。改良的CTAB法与改良的普通试剂盒法点样空仍有少量杂质,而改良的磁珠法试剂盒点样空干净无杂质。
4结语
由于木棉叶片中含有大量的多糖、多酚、萜类等物质,能成功地从木棉材料中提取高质量DNA的关键是如何有效的去除多糖、蛋白质及一些次生物质。采用常规的CTAB法、SDS法、及试剂盒均得不到较高质量的基因组DNA。CTAB法、SDS法、普通试剂盒及磁珠法试剂盒经过改良处理后DNA的综合质量均得到了提高。并且能用于下游分子生物学实验。这是由于在植物细胞中,生物膜将细胞不同部位隔离开形成不同区室,多酚、多糖及萜类等次生物质主要存在于细胞质中,所以在裂解细胞核前,先对其进行预处理,先将细胞破碎以除去细胞质中的多糖多酚及萜类等次生物质。并在细胞核裂解前加入少量的PVP粉,可与酚类物质结合形成水不溶性的复合物,同时也能与多糖结合,进一步去除预处理后余留的多酚多糖等杂质。本研究表明,改良后的CTAB法、普通试剂盒及磁珠法试剂盒均得到了较高质量的DNA。但各有其优缺点,改良后的CTAB法为一种较为经济的植物总DNA提取方法,但其耗时较长,所用药品中的苯酚、氯仿等对人体毒性很大,并且纯度不够高有少量的杂质。改良后的普通试剂盒其操作简单,耗时少,其纯度要比改良的CTAB法高,但其产率却偏低。改良的磁珠法试剂盒无论提取纯度、得率都为最好,其具有独特分离作用的磁珠和缓冲液系统,从样品中分离纯化高质量核酸,特殊包被的磁珠,在一定条件下对目的核酸具有很强的亲和力,而当条件改变时,磁珠释放吸附的核酸,能够达到快速分离纯化核酸的目的。整个过程不涉及有毒试剂,安全、便利、提取的核酸纯度高、质量可靠。但缺点是其费用较高。各实验室可以根据自己的实验要求及条件选择最适合的DNA提骨科医学论文取方法。
作者：田向楠 田斌 张雪娟 周知里 马焕成 单位：西南林业大学国家林业局西南地区生物多样性保育重点实验室
