１肝癌细胞系Ｌ２肝、脾原位接种小鼠生存率、肿瘤发生及侵袭转移情况
脾接种组１只裸鼠于接种后第２天死亡，肝、脾原位接种组裸鼠接种成功率分别为１００％（１０／１０）、９０％（９／１０）。肝原位接种组肝成瘤率为１００％（１０／１０），肉眼观察见明显肿瘤形成灶，肿瘤呈外生结节膨胀性生长（表１，图１），并与周围肝组织和腹壁侵袭粘连明显，腹腔内亦可见多数灰白色圆形、椭圆形播散性瘤结节及血性腹水形成（表２、３）；本组６只裸鼠发生肺转移（６０％，６／１０），肺表面可见灰白泡状转移结节，未见脾转移发生。脾原位接种组脾成瘤率７８％（７／９）、肝转移率６７％（６／９），肿瘤呈外生结节膨胀性生长，切面灰白色，质较硬（图２），与周围组织和腹壁亦有侵袭粘连，伴不同程度腹腔播散及血性腹水；本组肺转移率１１％（１／９），镜下见肺门淋巴结转移（３３％，３／９）。
２肝癌细胞系Ｌ２肝、脾原位接种肿瘤病理组织学特征
Ｌ２肝、脾原位接种瘤细胞以及肝转移瘤细胞镜下呈典型ＨＣＣ的巢团状分布，瘤细胞椭圆或不规则形，核大深染，核质比大，细胞异型性明显，并可见多量病理性核分裂象，在器官近包膜及实质内均有连片肿瘤组织分布（图３、４）。两种动物模型肺转移灶多分布在支气管周边及接近肺表面，尤其是肝接种组部分肺转移灶相互融合形成ＨＣＣ典型的巢团状结构。少部分肺转移灶瘤细胞呈散在分布，无典型巢团状排列，高倍镜下似“猫眼”状及呈不规则状。肝接种组肺转移程度和范围较脾接种组强而大（图５、６）。此外，肝、脾两种模型均可见不同程度的肺门淋巴结转移。
３讨论
ＨＣＣ是肝癌中最常见的组织学类型，其发病隐匿、恶性程度高，多数患者在临床确诊时已为中晚期。虽然早期肝癌患者经手术切除可取得良好的治疗效果，但对于中晚期肝癌患者的治疗，在过去３０多年来一直未能取得突破性进展［９］。因此，急需建立较为理想的动物模型，探讨肝癌药物干预疗效、ＨＣＣ发生、转移的规律及其机制等。明确肿瘤转移机制是降低肿瘤病死率的关键之一。裸鼠由于先天性胸腺发育不良，致Ｔ细胞生成障碍，细胞免疫功能缺陷，从而保证癌细胞裸鼠移植的可行性。Ｏｇａｗａ等［６］建立ＨＣＣ细胞系，并经裸鼠注射后表现出不同程度的转移潜能，其中Ｌ２细胞经皮下、尾静脉、腹腔注射后肺转移率分别为２０％、１００％、０。由于原位接种造模被普遍认为是最佳的造模方式［４］，因此本组首次利用Ｌ２细胞经裸鼠肝、脾原位接种造模，并比较肝、脾成瘤及肺转移情况，发现肝原位接种组肺转移率（６０％）明显高于脾接种组（１１％，Ｐ＜００５）；也高于Ｏｇａｗａ等［６］通过皮下（２０％，Ｐ＜００５）和腹腔注射（０，Ｐ＜００１）模型的肺转移率，本组虽低于尾静脉注射模型的肺转移（１００％，３／３），但Ｏｇａｗａ等构建此尾静脉模型时仅用３只裸鼠，二者差异无统计学意义。传统造模法认为，将肿瘤细胞接种到肿瘤原发部位的组织器官，可以获得与原发肿瘤相似的微环境基础，更有利于肿瘤生物学特性的研究［４］。如果从尾静脉注射肿瘤细胞，由于下腔静脉血流量及流动速度明显大于门静脉，即使不能完全排除一小部分瘤细胞可能会通过门静脉入肝，再转移到肺，但绝大部分瘤细胞会直接通过下腔静脉入心和肺，形成未经过肝脏微环境培育的肺转移灶。因此，相较于尾静脉注射模型，肝原位接种模型应该更具有原发性肝癌肺转移的生物学特性。尾静脉注射造模法具有操作较为简单与肺转移率较高等优点，如进行皮下或腹腔注射，瘤体位于皮下及腹腔，不具有原位性肝癌特征性的生物学行为，且不易形成腹水、黄疸及肺转移，但在肝癌的复发转移方面的研究具有一定的缺陷［１０］。因此肝原位接种造模能更好的模拟体内ＨＣＣ发生、转移等生物学行为，优于Ｏｇａｗａ等经皮下、尾静脉及腹腔注射构建的模型，能够为ＨＣＣ的发生、转移机制的研究及药物干预实验提供良好实验对象。本实验结果显示：Ｌ２细胞系虽源于肺转移灶肿瘤细胞，对肺组织具有更好的亲和性而表现出更高的转移率，但除了Ｏｇａｗａ等的尾静脉注射模型（肺转移率１００％）及本实验肝原位接种模型（肺转移率６０％）外，其余３种造模途径（皮下、腹腔及脾脏）的肺转移率均低［２－５］，其原因可能由于Ｌ２细胞系虽然源于肺转移灶，但在不同微环境下也有可能表现出肿瘤组织生物学特征的差异，即肿瘤异质性的体现。阮思蓓等［４，１１］报道肝原位接种造模时，可能会有一小部分瘤细胞未在肝组织环境中黏附生长，直接通过肝静脉入肺而失去肝组织特有“土壤”的培育，因此本实验同步进行脾原位接种造模，此途径中的瘤细胞无论是停留在脾组织还是直接入脾静脉，最后都会通过脾静脉－肝门静脉入肝而在肝脏“土壤”中培育，从而获得与ＨＣＣ发生及其自发转移更为相似的生物学特性。
本实验与本课题组前期实验结果比较［２－５］，肝原位接种组成瘤率１００％，且均不见脾转移，证明建立的动物模型符合血道转移规律；脾接种组成瘤率及肝转移率不及肝癌细胞系Ｃ６，却高于Ｃ１、Ｃ２，提示起源于肺转移灶的Ｌ２细胞对肝脏仍表现出一定的亲和力，也进一步说明同源细胞系具有不同的生物学特性。另外，本实验也出现了与Ｃ６细胞系接种相似的现象［６］，即有２只经脾原位接种造模小鼠未见肺转移却发生了肺门淋巴结转移。虽然冀学宁等［１２］报道肝癌细胞趋化因子及受体表达可能与其淋巴转移潜能有关，也有淋巴结跳跃式转移学说，但是肝癌从肝脏直接转移至肺门淋巴结还缺乏相应的解剖学基础［１３］，此现象的具体原因和机制还有待进一步研究。综上所述，大鼠肝癌细胞系Ｌ２肝、脾原位接种模型均易成瘤且伴不同程度肺转移发生，其中Ｌ２肝原位接种动物模型更适用于ＨＣＣ肺转移机制及体内药物干预实验的研究。
作者：刘勇 唐红 罗霞 阮思蓓 张元 唐明希
