1资料和方法
1．1一般资料
选取本院口腔科2012年9月—2013年9月收治的37例慢性牙周炎患者为观察组:其中男18例，女19例;年龄24～65岁，平均(43．5±8．25)岁。选取同期入院体检的31例健康志愿者为对照组:其中男14例，女17例;年龄22～64岁，平均(43．1±8．14)岁。纳入标准:①观察组Χ线显示炎症累及牙周深层组织，有牙槽骨吸收;②观察组牙周袋不小于3mm;③对照组与观察组受试牙齿对应牙齿为健康正常牙齿，无治疗史;④无龋齿、牙髓病变及咬合创伤等其他引发急性牙周炎的疾病;⑤无糖尿病、心血管疾病、风湿性骨病等能引发全身炎症或骨吸收的疾病;⑥受试者自愿并签署知情同意书。两组患者受试牙齿一致，年龄、性别差异无统计学意义(P＞0．05)。
1．2研究方法
1．2．1免疫荧光试验
采用吸潮纸尖法收集受试者龈沟液，以免疫荧光试验测定龈沟液OPG和ＲANKL的阳性表达程度。基本步骤:①4℃解冻，离心去除吸潮纸，取上清液，PBS洗涤并悬浮，滴加于载玻片;②2．0%多聚甲醛固定，1．0%牛血清白蛋白BSA室温封闭90min;③PBS洗涤，一抗孵育，4℃过夜，Anti-Osteoprotegerin(ab73400，5μg/mL，多克隆兔抗)和Anti-ＲANKL(ab12125，1μg/mL，单克隆小鼠抗)均由Abcam提供。④PBS洗涤，二抗孵育，室温90min，GoatAnti-ＲabbitIgGH＆L(AlexaFluor555，ab150086，5μg/mL)和DonkeyAnti-MouseIgGH＆L(AlexaFluor594，ab150108，5μg/mL)均由Abcam提供;⑤DAPI染核，滴加抗荧光淬灭封闭剂，激光共聚焦显微镜下观察;⑥每张玻片取3个视野，每个视野计数100个细胞，计算荧光强度。
1．2．2出血指数衡量方法
观察牙龈色泽，并以顿头探针轻压龈沟，观察出血情况，计分如下:①牙龈及龈沟外观健康，轻压无出血迹象计0分;②外观呈轻度炎症，有肿胀，但轻压无出血迹象计1分;③外观呈轻度炎症，有肿胀，且轻压后点状出血计2分;④外观呈中度炎症，有血肿，轻压有血液溢于龈沟内计3分;⑤外观明显血肿，轻压血液可溢于龈沟外计4分;⑥外观明显血肿，并伴有溃疡，自动出血或轻压大量出血计5分。
1．3统计学方法
采用统计学软件SPSS16．0分析数据，本组数据均为计量资料，以均数±标准差表示(x±s)，行两独立分组的t检验;相关性分析采用简单线性回归;P＜0．05为差异有统计学意义。
2结果
与对照组比较，观察组患者OPG和OPG/ＲANKL表达强度明显偏低，ＲANKL表达强度明显偏高，且各指标的组间差异均有统计学意义(P＜0．001)。经线性回归分析，观察组患者的OPG/ＲANKL的表达情况与其出血指数呈明显负相关(y=－3．7755x+3．6212，Ｒ2=0．6651，P＜0．05)。
3讨论
就病理特征而言，慢性牙周炎患者存在局部骨代谢紊乱，以破骨细胞为主导的信号通路活跃，导致病理性骨吸收。因此，理想的治疗方案不仅要消除炎症，还应恢复牙周组织的原有结构，使已吸收的牙槽骨获得再生。OPG和ＲANKL是骨吸收性疾病和骨炎症性疾病中研究颇为广泛的两种因子，也是骨生理机制及骨代谢性疾病防治的焦点。当前研究［3-4］已证实，OPG/ＲANKL/ＲANK系统是参与成骨细胞和破骨细胞代谢的主要信号通路，其中ＲANKL是破骨细胞的正性调节因子，可加强骨吸收过程;OPG是破骨细胞的负性调节因子，主要促进骨生成过程。既往研究［5-6］在骨质疏松、风湿关节炎及骨关节炎等疾病中发现OPG/ＲANKL可作为衡量患者骨密度的客观指标，且能够调节炎性细胞因子的表达。一方面，ＲANKL的升高能够促进TNF-α及IL-6等多种前炎性因子的表达，活化炎性反应过程;另一方面，TNF-α及IL-6能够削弱成骨细胞活性，同时刺激基质金属蛋白酶的合成，从而加速OPG讲解，形成OPG/ＲANKL持续降低、炎性反应持续加重的恶性循环。慢性牙周炎的临床病理特征与其他骨代谢性疾病具有典型相似性，即牙龈炎症和牙槽骨吸收。国内学者陈莉丽等［7］建立了骨吸收的体外细胞模型，发现牙槽骨吸收活跃区域ＲANKL高表达、OPG低表达的病理状态，指出OPG/ＲANKL可客观衡量牙槽骨吸收程度，同时也证实了OPG/ＲANKL/ＲANK系统在牙槽骨吸收机制中占据了重要地位。实质上，OPG/ＲANKL与牙槽骨吸收的相关性不乏国内外报道［8-9］，然其是否与牙周炎患者的炎症性出血有关，目前国内外的研究较少。本研究对慢性牙周炎患者与健康人群的OPG/ＲANKL的表达状态做了对比，发现观察组OPG和OPG/ＲANKL表达强度明显偏低，ＲANKL表达强度明显偏高，且各指标的组间差异均有统计学意义，初步证实了OPG/ＲANKL/ＲANKL可能参与了慢性牙周炎的发病过程。进一步的线性分析结果显示，观察组患者的OPG/ＲANKL的表达情况与其出血指数呈明显负相关，说明该系统不仅参与了牙周炎的骨吸收过程，尚与其炎性反应的发生、发展密切相关。综上所述，在慢性牙周炎疾病的发生和发展过程中，OPG/ＲANKL/ＲANK系统可能同时参与了牙槽骨吸收和牙龈炎症的病理过程，OPG/ＲANKL表达可作为衡量其炎症性出血程度的客观指标，能够为其临床诊治提供新靶点。
作者：吕旭君 单位：浙江省宁波市北仑区第二人民医院
