1.LR重组反应
在LR克隆酶作用下，亲本质粒pEGFP-PP和pTPO-PP发生重组反应，形成微环DNA和微质粒（图1）。LR重组反应体系为：亲本质粒200ng、10×TE缓冲溶液1μl、LR克隆酶2μl、加ddH2O至10μl。反应条件：25℃，4h。1.2.4转染HeLa细胞将HeLa细胞消化传代至12孔板，于细胞汇合度为80%~90%时进行转染。参照转染试剂GenJetPlus说明书进行。主要步骤如下：移除培养液，以PBS冲洗细胞2遍，加入600μl无血清DMEM培养液。然后配制转染复合物：在1.5mlEP管内加入DNA混合物，以无血清DMEM补足50μl，混匀。实验组DNA混合物为未纯化的LR重组体系10μl和4倍于微环DNA物质的量的pPGKPhiC31obpA质粒。对照组DNA混合物为与微环DNA等物质的量的对照质粒和5倍于对照质粒物质的量的pPGKPhiC31obpA质粒。因实验组LR重组产物中含有与微环DNA等物质的量的表达ΦC31整合酶的微质粒，故上述实验组及对照组DNA混合物中微环DNA及对照质粒的物质的量与ΦC31整合酶质粒物质的量比值均为1:5。在另一1.5mlEP管中按照DNA（μg）:转染试剂（μl）为1:3的比例加入GenJetPlus转染试剂，以无血清DMEM补足50μl，混匀。将上述转染试剂稀释液加入DNA混合物中，轻轻吹打混匀，室温静置20min后，将100μl转染复合物逐滴加入12孔板中，轻轻摇匀。另设不转染质粒的空白对照组。转染12h后，换新鲜的含血清DMEM培养液继续培养。
2.LR重组效率测定
以EcoRI酶切pEGFP-PP的LR重组产物来鉴定重组反应的发生：若发生重组，则微环DNA（pEGFP-MC）和微质粒分别被线性化，得到约2.0和5.3kb两条带；若未发生重组，则亲本质粒被切成约1.2和6.1kb两条带。以PvuⅡ酶切验证pTPO-PP的LR重组：若发生重组，则能切出约2.7kb（pTPO-MC）和5.3kb（微质粒）两条带；若未发生重组，则能切出约1.9和6.1kb两条带。可通过观察电泳图中各条带亮度粗略判断LR重组效率。此外，应用荧光定量PCR方法检测各质粒的拷贝数可较为精确地计算LR重组效率。在亲本质粒λattR两端设计引物MC-F和λattR-R（序列见表1）扩增该质粒的特有片段，检测亲本质粒的拷贝数；同时，设计引物MP-F和MP-R（序列见表1）扩增LR重组反应前后拷贝数不变的片段，作为定量PCR内参。以ddH2O替代LR重组反应体系中的LR克隆酶作为LR重组反应前样品。将两组亲本质粒pEGFP-PP和pTPO-PPLR重组反应前后样品分别稀释100倍和1000倍进行荧光定量PCR，通过标准曲线法进行绝对定量，比较LR重组反应前后亲本质粒的拷贝数，获得LR克隆酶的重组效率。
3结果
3.1LR重组效率鉴定结果
酶切鉴定电泳结果显示，重组体系中微环DNA和微质粒的条带亮度明显高于亲本质粒（图2A），直观地表明LR重组效率较高。荧光定量PCR检测结果可见，由两组亲本质粒pEGFP-PP和pTPO-PP的两个稀释梯度得出LR重组效率为82.56%±0.76%（表2）。GFP阳性细胞克隆中LR重组片段PCR鉴定结果表明，随机挑选的27个GFP阳性细胞单克隆中有23个为微环DNA整合（图2B、图2C），即LR克隆酶重组效率为85.19%（23/27），与荧光定量PCR结果一致。
3.2转染率的测定结果
流式细胞分析结果显示，微环pEGFP-MC的转染率显著高于传统质粒pEGFP-C，为其3.66倍（24.80%±10.21%vs.6.77%±1.61%，P=0.039，3次独立实验，图3A）。
3.3整合率的测定结果
转染2周后，克隆计数并计算外源基因在细胞基因组中的整合率。结果显示，微环pEGFP-MC和传统质粒pEGFP-C的整合率分别为0.82%±0.11%和0.52%±0.07%（图3B）。虽然微环DNA的整合率仅为传统质粒的1.58倍，但两者相比有显著统计学差异（P=0.014，3次独立实验）。
3.4蛋白表达水平的测定结果
以流式细胞仪检测经PCR鉴定为微环DNA整合的23个细胞克隆以及对照组pEGFP-C整合的8个细胞克隆的GFP荧光强度，分别为（958.60±328.11）和（137.99±83.46）（图3C），前者为后者的6.95倍，有极显著统计学差异（P<0.001）。此外，ELISA检测pTPO-MC和pTPO-C在转染后不同时期hTPO的表达水平，结果如图3D所示。转染2、4.5、7、9.5d时，微环pTPO-MC组hTPO蛋白表达水平均明显高于传统质粒组，前者为后者的4~12倍，有统计学差异（P<0.05，3次独立实验）。然而，pTPO-MC转染组和pTPO-C转染组分别在转染后第14.5天和第12天收集的培养液上清中即无法检测到目的蛋白hTPO的表达。
4讨论
ΦC31整合酶系统可介导含链霉菌attB位点及外源基因的质粒载体整合于哺乳动物基因组的假attP位点处。序列特征分析表明，假attP位点与野生型attP位点有一定的序列相似性，且多位于基因间或内含子区域[13]。因此，外源基因在假attP位点处的整合使得靶细胞基因组被破坏的风险明显低于随机整合，安全性有所提高。此外，由于该系统介导的目的基因整合后具有较好的表达水平，因而在基因治疗领域得到了广泛的应用[14]。但上述整合会将质粒载体上的细菌骨架序列也带入基因组，仍然存在安全隐患[2]。微环DNA是由传统质粒在大肠杆菌内通过位点特异性重组将其抗性标记基因、复制原点等细菌序列删除而得到的一种小环超螺旋分子，具有较高的转基因表达水平和安全性[3]。经典的微环DNA制备方法是以阿拉伯糖诱导重组酶的表达，重组酶介导其识别位点发生重组，形成含细菌骨架的微质粒和含目的基因表达盒的微环DNA，微环DNA必须与微质粒分离才能得到进一步的应用[3]。近年来，微环DNA的制备方法得到了多种改进[9,15]。与传统采用阿拉伯糖诱导方法不同的是，Tasic等[9]成功地利用LR克隆酶在体外反应中获得了微环DNA。然而，经典的阿拉伯糖诱导方法[16]和采用LR克隆酶制备微环DNA时[9]，为将微环DNA与微质粒分离，需要酶切消化微质粒和残留亲本质粒、纯化回收微环DNA等操作，微环DNA的产率很低。虽然优化的阿拉伯糖诱导法的微环DNA产率有所提高[15]，但其需要特定的工程菌株。为避免上述问题，本文联合应用LR克隆酶和ΦC31整合酶系统，结合两个系统的优势，建立了一种获得位点特异整合型微环DNA的方法：借助LR克隆酶将细菌骨架序列删除后，利用ΦC31整合酶系统实现目的基因的位点特异性整合。由于在利用ΦC31整合酶系统实现外源基因位点特异整合时，必须将含有attB位点和目的基因的质粒与表达ΦC31整合酶的质粒进行共转染[14]，因此本文在构建亲本质粒时在微质粒部分连入了ΦC31整合酶表达盒，使该微质粒在后续的转染实验中可被有效利用，而无需与微环DNA分离。该亲本质粒经LR重组后获得的微环DNA与表达ΦC31整合酶的微质粒的物质的量之比为1:1。我们的研究表明，在含attB位点质粒物质的量固定的情况下，共转染表达ΦC31整合酶质粒的物质的量越高，整合效率越高（两者比例在1:1~1:50的范围内，未发表数据）。因此，为保证实验中目的质粒有较高的整合效率，本文在将LR重组反应产物直接转染HeLa细胞的同时，额外加入4倍于微环DNA的表达ΦC31整合酶的质粒进行共转染，使含attB位点质粒与表达整合酶质粒的物质的量之比达到1:5（与对照组一致）。实验表明，LR克隆酶可高效介导亲本质粒的LR重组，微环DNA的产率达到80%以上，产物中微环DNA与残留亲本质粒的物质的量之比为（4.38±0.44），是优化的阿拉伯糖诱导方法[15]的近3倍（4.38/1.51，P<0.001）。且该LR重组产物无需纯化，可直接转染HeLa细胞系，避免了回收过程中的损失，大大减少了实验操作步骤和时间。未来可尝试对LR重组反应程序进行优化，如LR克隆酶分批加入、增加LR克隆酶用量以及延长反应时间等，尽可能提高微环DNA的产率，减少残留亲本质粒的含量。ELISA及流式细胞分析结果显示，与传统质粒相比，微环DNA转染组的目的蛋白GFP和hTPO均呈现明显的高表达状态，这可能与微环DNA具有较高的转染率以及不含细菌骨架序列有关[17]。然而，微环pTPO-MC在转染后第14.5天收集的培养液上清中即无法检测到目的蛋白hTPO的表达。这可能是由于微环DNA不含真核筛选基因，细胞在未加压传代生长过程中，整合外源基因的细胞逐渐被具有生长优势的未整合细胞淹没[18]，使得目的蛋白表达不断降低直至消失。相比之下，由于以GFP为目的基因的微环载体转染细胞在低密度培养过程中未进行传代处理，因此不存在上述与hTPO表达类似的现象，转染14d后仍可观察到GFP表达。随后的GFP阳性细胞克隆化培养结果表明，克隆化操作是获得稳定整合并表达目的基因细胞克隆的有效途径。因此，未来可联合应用其他重组酶系统，如Cre/loxP系统以及FLP/FRT系统，在构建亲本质粒时将两端有同向重组酶识别序列的真核筛选基因连接入微环DNA部分，药物筛选获得目的细胞后，诱导重组酶表达删除筛选基因，有望实现安全、高效、无标记的转基因。总之，本文联合利用LR克隆酶和ΦC31整合酶建立了一种获得位点特异整合型微环DNA的方法，为微环DNA作为转基因操作的理想载体奠定了良好的基础。
作者：刘浏 周在威 马晴雯
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